流式细胞分析技术.

流式细胞仪分析技术及应用

第一节概述

一、工作原理

二、散射光的测定

三、荧光测量

四、细胞分选原理

第二节数据的显示与分析

一、参数

二、数据显示方式

三、设门分析技术

第三节流式细胞仪技术要求

一、检测样品制备

二、常用的荧光染料与标记染色

三、胶乳颗粒的应用

四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用

一、细胞周期和DNA倍体分析

二、染色体分析

三、细胞表面标志的检测

1、淋巴细胞及其亚群的分析

2、淋巴细胞功能分析

3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型

四、肿瘤耐药相关蛋白分析

五、AIDS病检测中的应用

六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析

七、移植免疫中的应用

流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。

是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。

广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术

流式细胞术发展史:

•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

•1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞

•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白

•1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利

•1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

•1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器

•1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计

•1972年Herzenberg研制出细胞分选器

•1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

•大量厂家不断生产流式细胞仪

•目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司

流式细胞术的特点：

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选

细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细

胞群体的均值和分布情况；分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。

流式细胞仪分为三大类：

一类为台式机（临床型）：

BD FACSCalibur流式细胞仪特点：1、仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。2、两激光配置：488nm 633nm 3、检测参数：四荧光参数两个散射光参数

4、分析型流式细胞仪

5、应用：细胞分析检测

第二类为大型机（科研型）

特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。第三类为新型流式细胞仪：

随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4 根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。

BDFACSAria流式细胞仪：

高速分析分选流式细胞仪；高速分析；高速分选；3根激光：488nm 、633nm、375nm结合特制高性能石英杯流动室；应用：细胞分析分选、sp细胞检测

一、流式细胞仪的基本结构：

一般分为5 部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

概括为三个系统结构：

（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统

光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。

光学测量台：完成光学信号测量和转换

电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。

1、液流系统

由样本和鞘液组成

待测细胞→单个细胞的悬液→荧光染料标记的单抗对其染色→受清洁气体压力→从样品管进入流动室形成样本流

鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli 方程：P=(1/2)PV （勿略高度的变化）

真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一个恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。

改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

2、激光源和光学系统

激光光源：采用气冷式氩离子激光器

分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜

透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通

光电倍增管（PMT）：FSC, SSC（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）

激光光源与光束成形系统

大多采用氩离子气体激光器：

激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为 1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。

激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm 即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。

这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。

激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

光学系统

由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器

主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3 类：

1、长通滤片：（long-pass filter, LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸

收或返回。

2、短通滤片（short-pass filtr, SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500

μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（band-pass filter, BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有

两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。

如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

3、数据处理系统: 主要由计算机及其软件分析系统组成

二、流式细胞术的工作原理