EpacRap1信号途径介导H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及其分子机制
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Epac/Rap1信号途径介导H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及
其分子机制
目的:研究 Epac/Rap1(exchange proteins directly activated by
cAMP-Ras-related protein 1)信号通路在H9c2细胞缺氧复氧损伤中的作用及其分子机制,为临床治疗心肌缺血再灌注损伤寻求新的靶点提供理论与实验依据。
方法:1.采取体外缺氧/复氧(H/R)模拟体内心肌缺血再灌注损伤。
实验分为对照组、模型组(OGD)、OGD+Epac1 激动剂组(OGD+8-CPT)、
OGD+Epac1 抑制剂组(OGD+ESI-09)、OGD+Epac1 激动剂+PKA 抑制剂组
(OGD+8-CPT+H-89)、OGD+Epac1 抑制剂+PKA 抑制剂组(OGD+ESI-09+H-89)6 组。
MTT 及 LDH 检测细胞活力与损伤,钙离子荧光探针(Fluo-3AM)检测细胞内
[Ca2+]i含量;Western Blot、qRT-PCR、IF观察Epac1表达及下游Rap1活性形式Rap 1-GTP的表达。
2.采取体外缺氧/复氧(H/R)模拟体内心肌缺血再灌注损伤。
实验分为对照组、模型组(OGD)、OGD+Epacl 激动剂组、OGD+Epacl 抑制剂组、Epacl-shRNA干扰组、Epac2-shRNA 干扰组、OGD+Epacl-shRNA 干扰组、OGD+Epac2-shRNA干扰组
8组。
MTT检测细胞活力,钙离子荧光探针(Fluo-3 AM)检测细胞内[Ca2+]i浓
度;Western Blot方法检测心肌细胞中Epac1、CaMK-II、Rap1-GTP和p-ERK蛋
白变化;实时荧光定量PCR检测Epac1、Rap1的mRNA的表达变化;Co-IP检测细
胞中Epac1与Rap1的相互作用。
结果:1.与正常对照组相比,OGD组心肌细胞缺
氧5h复氧1h后,心肌细胞活力降低,LDH量释放增加,心肌细胞中Epac1激活,表达上调,其下游Rap1活性形式Rap 1-GTP的表达增加,促进心肌细胞损伤;Epac
激动剂8-CPT不仅增强心肌细胞Epac1过表达,而且增加了 Epac下游Rap1活性形式Rap 1-GTP的表达,并导致胞内钙超载,加重心肌细胞损伤;Epac抑制剂
ESI-09可抑制心肌细胞Epac1的激活与过表达,抑制下游Rap1活性形式Rap
1-GTP的表达与CaMKII蛋白的表达,并增加ERK的磷酸化,抑制钙超载从而减轻心肌细胞损伤;H-89对心肌细胞Epac1的表达和下游Rap1的活化有轻度抑制作用。
2.采用慢病毒稳转将心肌细胞Epac1基因沉默后进行缺氧复氧实验发现,心肌细胞活力较单纯OGD组升高,心肌细胞中的Epac1蛋白表达被抑制,其下游Rap1活性形式Rap 1-GTP的表达减少、细胞内钙离子浓度下降,并抑制细胞ERK 磷酸化;心肌细胞Epac2基因沉默后继续缺氧复氧实验发现,细胞活力较单纯OGD 组无明显变化,心肌细胞内的Epac2蛋白表达被抑制,Epac1及其下游相关蛋白、胞内钙离子浓度则无明显变化,ERK磷酸化减少。
免疫共沉淀实验发现,利用Epac1或者Rap1抗体分别进行免疫共沉淀试验后,结果显示均能够检测到Epac1与Rap1之间的相互作用。
结论本课题研究结果显示Epac1可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点,Epac/Rap1信号通路可能是心肌细胞缺氧复氧损伤的途径。