钴原卟啉对H9c2心肌细胞缺氧_复氧损伤的保护作用(1)

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2009 Mar;25(3)
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物酶标记的二抗 (北京中杉金桥 ), ECLplus和细 胞核 -胞质蛋白提取试剂盒 (北京普利莱生物制品 有限公司 ), COPP和 ATRA(Sigma), Znpp(InternationalLaboratory), BCA蛋白定量试剂盒 (杭州碧云 天生物技术有限公司 ), 其他试剂均为国产分析纯 。 1.3 H9c2心肌细胞的培养和实验分组 H9c2细 胞株在含 10%胎牛血清高糖 DMEM完全培养基中 培养 (条件为 37℃, 5% CO2 ), 2 ～ 3 d传代 1次 。实 验时取对数生长期细 胞 , 将细 胞随机分成 5 组 :① 对照组 :正常培养细胞不做任何处理 ;② 缺氧 /复氧 组 :加入饱和氮气 pH 6.8D-Hanks液培养细胞 2 h, 再用 DMEM完全培养基培养细胞 6 h。 ③ COPP预 处理组 :用含 10 μmol· L-1 COPP的 DMEM完全培 养基 预 处 理 细胞 12 h(除 检 测 HO-1 mRNA时 , COPP预处理细胞时间为 4 h), 然后进行缺氧 /复氧 处理 ;④ COPP+Znpp组 :用含 10 μmol· L-1 COPP 和 20 μmol· L-1 Znpp的 DMEM完全培养基预处理 细胞 12 h(除检测 HO-1 mRNA时 , COPP和 Znpp预 处理细胞时间为 4 h), 然后进行缺氧 /复氧处理 ;⑤ COPP+ATRA组 :用 含 10 μmol· L-1 COPP和 1 μmol· L-1 ATRA的 DMEM完全培养基预处理细胞 12 h, 然后进行缺氧 /复氧处理 。 1.4 生化指标的测定 按照试剂盒说明书 , 测定心 肌细胞上 清液 中 乳酸 脱 氢酶 (LDH)和肌 酸 激酶 (CK)活力水平 。 1.5 RT-PCR检测 HO-1 mRNA表达 用 TRIzol 试剂提取总 RNA, 紫外分光光度计测量 RNA样品 的纯度 , OD260 /280 值大 于 1.7 的样品 按两 步法 RTPCR试剂 盒说 明进 行 逆转 录 和 PCR操 作 。 其中 HO-1引 物 :上游 5′GCTCTATCGTGCTCGCATGA下 游 5′AATTCCCACTGCCA-CGGTC3′, 扩增 DNA片段 大小为 319 bp;β -actin引物 :上游 5′CCCTAAGGCCAACCGTGAA 3′, 下 游 5′CCGCTCATTGCCGATAGTGA3′, 扩增 DNA片段大小为 430 bp;PCR条件 为 :94℃预变性 2 min, 94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 共进行 30个循环 , 最后再 72℃延 伸 10 min。 PCR产物以 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离 鉴定 , 紫外凝胶成像系统进行半定量分析 。 1.6 Westernblot检测 心肌细胞 HO-1 蛋白表达 水平 收集各组细胞 , 用 PBS洗涤 3次 , 加入含有 PMSF的细胞裂解液 , 冰上作用 30 min, 4℃, 12 000 r· min-1离心 15 min, 取上清进行蛋白质定量 , 取 50 μg总蛋白样品 于 12%变性 聚丙烯酰 胺凝胶电 泳 , 随后转印至 PVDF膜 , 用 5%脱脂奶粉封闭后加 入 1 ∶1 000一抗 (β-actin, HO-1)37℃孵育 1.5 h, 二
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中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2009 Mar;25(3):352 ～ 6
钴原卟啉对 H9c2心肌细胞缺氧 /复氧损伤的保护作用
朱晓洁 , 梁 飞 , 王秀宏 , 赵炜明 , 高 旭
(哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 , 黑龙江 哈尔滨 150086)
Fig1 ExpressionofHO-1mRNA inH9c2 myocytesof differentgroupsandtheirresultanalysis(x±s, n=3) M:Marker;1:Controlgroup;2:Hypoxia/reoxygenationgroup;3: COPPpretreatmentgroup;4:COPP+Znppgroup.＊ P<0.05 vscontrol group;■ P<0.05, ■■ P<0.01 vshypoxia/reoxygenationgroup.Intensityofeachbandwasquantifiedbydensitometry, anddatawerenormalized byusingtheactinsignal.Controlgroupwasdetectedasabasallevel( designatedas1), andtheotherswereexpressedasfoldscomparedwith control.
HO-1过表 达的 理想 药 物 。 在 H9c2 心 肌 细胞 中 , COPP对心肌细胞缺 血 /再灌 注损伤的影响 及其机 制 , 目前国内外尚未见报道 。 本实验通过模拟体内 心肌缺血 /再灌注 , 研究探讨 COPP在体外培养的心 肌细胞缺氧 /复氧损伤中的作用及其分子学机制 , 有 望为心肌缺血 /再灌注损伤的治疗提供一个新的思 路。 1 材料与方法 1.1 实验细胞株 H9c2大鼠心肌细胞株购自上海 生命科学研究院细胞库 。 1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒和 TRIzol(Invitrogen), 乳酸脱氢酶 (LDH)和肌酸激酶 (CK)试剂盒 (南京建成 生物工程 研究所 ), HO-1一抗 (Santaruz C), Nrf2 一抗 (ABcam), β -actin一抗和辣根过氧化
Fra Baidu bibliotek
抗浓度为 1 ∶4 000, 37℃孵育 1 h, X线片曝光 , 显 影 。 实验结果使 用 BIORADGS-800 系统扫 描 , 并 定量分析 X线片条带的光密度 。实验重复 3次 。 1.7 H9c2心肌细胞细胞核 Nrf2蛋白表达水平的 检测 生长良好的心肌细 胞施加因素后去 除培养 液 , 按细胞核 -胞质蛋白提取试剂盒说明提取细胞 核中的 Nrf2 蛋白 。 用 BCA试 剂盒进行蛋白定 量 。 取 50 μg蛋白于 12% SDS-PAGE分离蛋白质 , 转印 至 PVDF膜 , 封闭 后 加入 1 ∶1 000一 抗 (β-actin, Nrf2), 37℃孵育 1.5 h, 二抗浓度为 1 ∶4 000, 37℃ 孵育 1 h, X线片 曝光 , 显影 。 实 验结果使 用 BIORADGS-800系统扫描 , 并定量分析 X线片条带的 光密度 。 实验重复 3次 。 1.8 统计学处理 实验数据用 x±s表示 , 统计学 处理使用 SPSS12.0 统计软件 , 采用方差分析方法 判断其差异显著性 。 2 结果 2.1 COPP预处理对 HO-1 mRNA和蛋白表达水 平的影响 对照组 HO-1 mRNA和蛋白表达水平很 低 , 缺氧 /复氧组的 HO-1 mRNA和蛋白表达水平
氧 , H2O2, 紫外线照射等 。 近年人们发现 HO-1在有 害刺激和疾病条件下对机体具有保护作用 , 特别是 诱导 HO-1 过表达在抗缺血 /再灌注方面具有很好 的功效[ 2 ～ 5] 。 COPP是 至今发现 的金属卟 啉类的 最有 效的 HO-1诱导剂 , 而且在细胞内不会分解代谢生成活 性氧族 , 不会增加氧化应激 [ 6] 。 因此 , COPP是诱导
groupsandthecontrolgroupunderhypoxiccondition wasdetectedbythereal-timefluorescencequantitative RT-PCR.Results ExpressionofHIF-1α wassignificantlyincreasedunderhypoxiacondition.HIF-1 αhad nochangeaftertreatmentwithemodinalone.TheexpressionlevelofKU70 /KU80 wasinducedbyradiation.Comparedwithradiationalonegroup, radiation combinedhypoxiagroupobviouslyenhancedtheexpressionofKU70/KU80.KU70 /KU80 mRNAexpressionsignificantlyreducedafterradiationcombinedwith
关键词 :血红素加氧酶 -1;钴原卟啉 ;缺氧 /复氧 ;Nrf2-ARE
收稿日期 :2008 -11 -05, 修回日期 :2008 -12 -28 基金项目 :黑龙江省自然科学基金资助项目 (NoD2006-09);黑龙江
省博士后启动基金 ;哈尔滨医科大学医学基础学科青年科 学基金资助项目 作者简介 :朱晓洁 (1982 -), 女 , 硕士生 , 研究 方向 :血红素代 谢及 相关 疾 病 , Tel:0451-86671684, E-mail:zhuxiaojie0070 @ hotmail.com; 王秀宏 (1970 -), 女 , 副教授 , 硕士生导师 , 研究方向 :血 红素代谢 及相 关 疾病 , 通 讯作 者 , Tel:0451-86671684, Email:wangxh700417@ yahoo.com.cn
中 国 图 书 分 类 号 :R-332;R 322.11;R 329.2;R 342.22; R 345.41;R 542.2;R 845.22;R 977.3 文献标识码 :A 文章编号 :1001 -1978(2009)03 -0352 -05 摘要 :目 的 研究钴 原卟 啉 (COPP)预处 理在 H9c2心肌 细 胞缺氧 /复氧损伤中的作 用及分 子机 制 。 方法 建立 H9C2 心肌细胞 缺氧 /复氧 模 型 。 在 H9c2 心 肌细 胞 缺氧 /复氧 前 用 COPP预 处 理 , 并 用 锌 原 卟 啉 (Znpp), 全 反 视 黄 酸 (ATAR)分 别 抑制 HO-1 及 Nrf2-ARE。 检 测细 胞 上清 液 中 LDH、CK的水 平变化 ;用 RT-PCR法分 析 HO-1 mRNA表 达 水平 ;Westernblot分析 HO-1、Nrf2的蛋白表达水平 。 结果 与缺 氧 /复氧 组比 , COPP预处 理组 中 LDH和 CK水 平均 明 显降低 , 而 HO-1 mRNA水平 , 蛋白 水平 及细 胞核 的 Nrf2 蛋 白水平均明显增加 ;Znpp的加入阻断了 COPP预处理对心肌 细胞 的保 护作 用 ;ATAR的 加入 抑制 了 Nrf2在 细胞 核的 聚 集 , 进而抑制了 COPP对 HO-1的诱导 。 结论 COPP预处理 诱导 H9c2心肌细胞 HO-1过表 达 , 具有 抗心肌细 胞缺氧 /复 氧损伤的保护作用 ;其机制与 Nrf2-ARE信号通路 相关 。
心肌缺血 /再灌注是一个重要的临床问题 , 而临 床上对心肌缺血 /再灌注的防治尚缺乏有效的方法 。 因此 , 心肌缺血 /再灌注损伤中心肌保护因子的研究 成为当今研究的热 点 。 血红素 加氧酶 1(HO-1)是 血红素分解代谢的起始与限速酶 , 可将血红素分解 成胆 绿 素 , CO和 铁 。 HO-1 是 一 种 热 休 克 蛋 白 (HSP32)[ 1] , 可被多种因素诱导过表达如重金属 , 低
emodinunderhypoxiccondition.Conclusion Inthe hypoxicenvironment, emodincombinedwithradiotherapycaneffectivelyinhibittheexpressionofHIF-1 α andDNA double-strandbreakrepairgenes(KU70/ KU80), whichmaybeitsmechanismofradiosensitization. Keywords:emodin;hypoxia;repairgene;real-time fluorescencequantitativeRT-PCR;nasopharyngealcarcinoma