关于硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

关于硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

【关键词】硫化氢后处理心肌细胞培养缺氧复氧损伤大鼠

Abstract： Objective To explore the protective effects of H2S donor-NaSH postconditioning on the primary-cultured neonatal rat myocardial cells exposed to hypoxia/reoxygenation （H/R） injury. Methods Primary- cultured myocardial cells from neonatal rats were randomly pided into 4 groups: control group（normal）， hypoxia/reoxygenation group（H/R），hypoxia postconditioning group（HPC） and NaHS postconditioning group

（H/R+NaHS）. A model of H/R injury was reproduced by exposing the cell culture to 2 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation. The percentage of surval cells， the activities of lactate dehdrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD)， and the content of malondialdehyde (MDA) were determined at the points of pre-hypoxia， hypoxia for 2 h and reoxygenation for 0.5 h ，1 h and 2 h. Results No obvious changes were detected in H/R group， HPC group and H/R+ NaHS group until hypoxia 2 h. After standard hypoxia postconditioning and NaHS postconditioning respectively， the surval rate was higher in the HPC and H/R+ NaHS groups than in the H/R group ［(70.5±2.2）% and （66.2±2.5）% vs （61.3±1.8）%， P�0.05］. Meanwhile the activities of LDH in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than that in H/R group ［

(36.2±1.3）U·L-1 and （39.5±1.5） U・L-1 vs （44.6±1.7） U・L-1，

P�0.05］. The contents of MDA in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than in H/R group ［(0.905±0.033） mmol・g-1 and

（0.986±0.042） mmol・g-1 vs （1.120±0.045） mmol・g-1， P�0.05］; but the SOD activity was significantly higher in HPC group and H/R+ NaHS group than in H/R group ［(16.9±1.0） U・L-1 and （159±1.2） U・L-1 vs （13.3±1.5） U・L-1， P�0.05］. During the whole 2 hours of reoxygenation， the survival rate of cells and the SOD activity in HPC and H/R+ NaHS groups remained higher than in the H/R group， and the activity of LDH and the content of MDA kept to be lower than in H/R group (P�0.05). Conclusion NaHS postconditioning offers protective effect on myocardial cells against hypoxia/reoxygenation injury by enhancing the scavenging of oxygen - derived free radicals.

Key words： H2S; postconditioning; myocardial cell culture;

hypoxia/reoxygenation injury; rat

缺血后处理(ischemic postconditioning)［1］是可以有效对抗缺血/再灌注损伤的一种重要内源性保护机制，长时间缺血后再灌注前，短时间内反复短暂的再缺血处理，可以明显减轻缺血组织的缺血/再灌注损伤。药物后处理是用药物模拟缺血后处理的方式，试图达到与缺血后处理相似的保护效果。内源性硫化氢

（H2S）作为新发现的气体信号分子，其心肌保护作用近年来受到高度的关注。研究发现，缺血前给予外源性硫化氢钠（NaHS）可改善因缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI）引起的心肌功能障碍和心肌损伤［2］。但NaHS后处理的心肌保护作用尚未见报道。本研究采用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞，建立缺氧/复氧损伤模型，探讨NaHS后处理对培养心肌细胞IRI的保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料胎牛血清（杭州四季青有限公司）；DMEM培养基（GIBCO，America）；胶原酶I、胰蛋白酶（Sigma）；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)、超氧化物歧化酶(super oxidedismutase， SOD)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒，考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所出品；其余试剂均为国产分析纯产品。二氧化碳培养箱（上海），

N750紫外分光光度计（上海）。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞原代培养选出生1～3天内的Sprague Dawley大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供），雌雄不限。参照文献［3］方法分离、纯化心肌细胞，制成浓度为1×109・L-1 的细胞悬液，接种于24孔培养板。取原代培养72 h的心肌细胞进行实验。

1.2.2 实验分组将同批培养的心肌细胞随机分为4组。①对照组（Normal 组）：将心肌细胞放入37℃含95%空气、5% CO2的二氧化碳培养箱中，用复氧液〔mmol・L-1， 0.9 Na2HPO4，20.0 NaHCO3， 1.8 CaCl2，1.2 MgSO4， 55.0 葡萄糖， 20.0 HEPES(hydroxyerhyl piperazine erhanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸)，129.5 NaCl和5.0 KCl，pH 7.4〕培养4 h。②缺氧/复氧组（H/R组）:参照文献［3］，将心肌细胞换用高纯氮气饱和30 min、氧分压低于7 kPa的模拟缺氧液(mmol・ L-1，0.9 Na2HPO4、6.0 NaHCO3、1.8 CaCl2、1.2 MgSO4、40乳酸钠、20 HEPES、98.5 NaCl和10.0 KCl、pH 6.8)，并置于37℃含95% N2、5% CO2的密闭容器中缺氧2 h，然后换为复氧液在二氧化碳培养箱中复氧2 h。③缺氧后处理组（HPC组）：缺氧2 h后，参照文献［4］方法给予缺氧后处理。先用复氧液培养5 min，然后换为缺氧液培养5 min，复氧液5 min/缺氧液5 min重复3次，共计30 min，再继续用复氧液培养1.5 h。④硫氢化钠后处理组（H/R+NaHS 组）：后处理方式同HPC组，用含NaHS复氧液（用复氧液配制，NaHS终浓度为

1×10- 6 mo l・L-1，此浓度为预实验所选定）代替缺氧液给予后处理。

1.2.3 观察指标及检测方法每组重复6次，在5个时间点（缺氧前、缺氧2 h和复氧后 0.5 h、1 h、2 h）进行指标测定。

1.2.3.1 台盼蓝排斥试验制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10-6・L-1。然后将心肌细胞悬液0.1 ml和4 g・L-1台盼蓝溶液0.1 ml混匀，用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。按公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=活细胞总数