黄芪注射液对培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的保护作用.

【摘要】目的研究黄芪注射液抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用。方法采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型，实验分为六组：A正常

对照组，B缺氧组，C黄芪20组，D黄芪100组，E黄芪200组，F黄芪400组。黄芪各组缺氧过程中给予不同浓度黄芪，缺氧4 h，复氧2 h。比较缺氧复氧前后心肌细胞存活率，培养液中心肌酶含量。结果各组缺氧前后谷草转氨酶(GOT)均有差异。复氧后2 h，B、C、D组培养液中心肌酶含量均有不同程度升高(P＜0.05)。E、F组GOT值较基础值降低(P＜0.05)。与正常组比较，各组细胞经过缺氧复氧后，存活数均有不同程度下降(P＜0.01)。与缺氧复氧组比较，加入黄芪保护的黄芪20，黄芪100，黄芪200组均优于单纯缺氧复氧组。黄芪200组存活率最高(P＜0.01)。结论黄芪能够减轻培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤。

【关键词】再灌注损伤心肌保护细胞培养流式细胞术细胞低氧The Protective Effect of Astragalus Injection on

Abstract: OBJECTIVE To evaluate the protective effect of astragalus injection on reperfusion injury cardial myocytes. METHODS Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h. Astragalus injection was applied to cells during

ischemia/reoxygenation and the extent of cell death and myocardial enzyme was determined after 120 minutes of reperfusion. RESULTS In cells, incubation with astragalus during reoxygenation attenuated the extent of cell damage and also reduced the number of apoptotic cells. CONCLUSION This study shows that astragalus attenuates cardiac myocytes injury during reperfusion.

Key words：Astragalus; Cardioprotection;Cell culture; Cell hypoxia

提高心肌保护效果是心血管外科不断发展的要求。通过药物方法进行心肌保护标志着其中的一大进步。本研究采用培养心肌细胞探讨黄芪注射液的抗再灌注损伤作用，尝试为中药在心肌保护中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原代心肌细胞培养1～3 日龄Sprague Dawley大鼠（由解放军总医院实验动物中心提供），纱巾法培养［1］。0.25%胰酶消化培养瓶内单层细胞制备单细胞悬液，按实验要求的细胞量获取原代心肌细胞。接种于培养瓶或培养板内。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱（REVCO公司，美国）内培养24h 使细胞贴壁生长。经鉴定90％以上为心肌细胞，90％以上为活细胞即可用于实验。

1.2 缺氧/复氧心肌细胞模型制备制备单细胞悬液，按实验要求细胞数目接种于培养板或培养瓶内。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h 使细胞贴壁生长。实验前更换含1%胎牛血清DMEM培养液培养24 h。更换相应缺氧缓冲液。缺氧缓冲液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose 10 mM, sodium lactate 20 mM)［2］为高钾低pH(pH 6.2）溶液，更好地模拟了心脏中的细胞暴露于无氧条件的情况。其后将细胞置于用配气（95%N2+5%CO2，北京普莱特斯公司）饱和的容器中，向其中持

续充入配气，燃蜡熄灭后再饱和10 min，充分驱赶容器中的氧气后迅即密封容器，放入孵箱37℃，培养4h。4h后恢复有氧环境，倾去缺氧缓冲液，换正常10％血清DMEM培养基后将细胞置于5%CO2孵箱中，于复氧条件下继续培养

2h，造成心肌细胞缺氧复氧损伤。

1.3 黄芪浓度对缺氧/复氧细胞凋亡影响六个培养瓶细胞，每培养瓶细胞总数1×106，培养瓶随机分为6组，编号为A组，B组，C组，D组，E组，F组。A组正常对照组，不加入黄芪，也不进行缺氧复氧处理。B组，C 组，D组，E组，F组均为缺氧／复氧组，其中黄芪终浓度依次为0 μl/ml，20 μl/ml，100 μl/ml，200 μl/ml，400 μl/ml黄芪培养液。实验开始时B 组，C组，D组，E组，F组更换相应缺氧培养液，黄芪注射液终浓度分别为0 μl/ml，20 μl/ml，100 μl/ml，200 μl/ml，400 μl/ml，37℃孵育缺氧培养4h。复氧时各组更换含相应浓度黄芪的10%胎牛血清DMEM培养液入培养箱培养2h；正常对照组A组实验过程中入培养箱培养6h。

实验结束时，六组细胞经0.25%胰酶消化制备单细胞悬液，磷酸盐缓冲

液离心洗涤2次(1000rpm，3 min)。细胞沉淀加入5 μl Annexin-V-FITC染液室温避光染色10 min。加入5 μl PI染液室温避光染色10 min。加入400

μl 缓冲液重悬细胞沉淀后入流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）进行检测（凋亡检测试剂盒Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit 1：BD Pharmingen BD Biosciences）。

1.4 黄芪对缺氧/复氧细胞培养液心肌酶的影响制备单细胞悬液接种于24孔板内，每孔接种3 ml细胞悬液（3×104个细胞/孔）。37℃，

5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h使细胞贴壁生长。更换培养液，每板四组，各复5孔。黄芪注射液终浓度分别为0 μl/ml，20 μl/ml，100 μl/ml，200 μl/ml，400 μl/ml培养液。37℃孵育。于24 h后取培养液0.5 ml在全自动生化分析仪上测定心肌酶。

1.5 统计方法采用SAS软件v8.2版本进行统计学分析。平均值以均数±标准差(±s )表示，心肌酶缺氧前和缺氧后组间两两比较采用单因素方差分析，各组缺氧前后比较采用配对t检验。组间存活细胞数比较采用X2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养液心肌酶的变化单因素方差分析显示，缺氧前组间两两比较结果显示，谷草转氨酶(GOT)基础值无统计学差异(P＝0.1427＞0.05)。缺氧后组间两两比较结果显示，E组,F组与其它各组均有差异，E组和F组之间

也有差异。配对t检验结果显示，各组缺氧前后GOT均有差异。复氧后2h，B 组、C组、D组均有不同程度升高，P＜0.05。E组、F组GOT值较基础值降低，P＜0.05，见表1。表1 黄芪对复氧心肌细胞GOT的影响

2.2 黄芪对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响研究黄芪浓度对复氧心肌细胞存活数的影响显示，与A组比较，各组细胞经过缺氧复氧后，存活数均有不同程度下降，P＜0.01。与B组比较，加入黄芪保护的C组，D组，E组均优于B组。E组存活率最高。差异有统计学意义，P＜0.01。见表2。表

2 不同浓度黄芪对复氧心肌细胞存活数的影响注：＃与A组比较，P＜

0.01；＊与B组比较P＜0.01

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)是指缺血期处于可