缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究

缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究

DAI Wen-zhi;YE Wen-feng;HE Yuan;CHEN Can;HUANG Shi-an;LEI Wei;GUO Jun

【摘要】目的:探讨缺氧复氧条件下不同复氧时间致心肌细胞损伤的途径.方法:培养人心肌AC16细胞,先置入1％O2、无糖无血清条件下培养24 h,再更换含10％胎牛血清的低糖DMEM联合21％O2进行不同时间的复氧培养,采用CCK-8法检测细胞活力,并通过Western blot法检测不同细胞损伤途径标记分子的蛋白水平,如细胞自噬相关蛋白LC3-II/-I、细胞焦亡相关蛋白caspase-1和gasdermin D 及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl2.结果:与空白对照组相比,各缺氧复氧组细胞活力降低,且随复氧时间延长,细胞活力相应持续降低(P<0.05),同时缺氧组LC3-II/-I上调(P<0.05),而复氧后LC3-II/-I较缺氧组下降,但仍高于对照组;此

外,cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白在复氧6 h组和复氧12 h 组表达水平上调(P<0.05);cleaved caspase-3水平和Bax/Bcl2在复氧12 h组上调(P<0.05).结论:缺氧致心肌AC16细胞的自噬上调,并随复氧时间增加自噬水平减弱,且在复氧过程中细胞焦亡的激活早于细胞凋亡.

【期刊名称】《中国病理生理杂志》

【年(卷),期】2019(035)007

【总页数】4页(P1232-1235)

【关键词】缺氧复氧;心肌细胞;细胞自噬;细胞焦亡;细胞凋亡

【作者】DAI Wen-zhi;YE Wen-feng;HE Yuan;CHEN Can;HUANG Shi-an;LEI Wei;GUO Jun

【作者单位】;;;;;;

【正文语种】中文

【中图分类】R363.2;R541.4

缺血性心脏病是心血管系统中致死率和致残率最高的疾病之一，临床使用经皮冠状动脉介入术疏通狭窄甚至闭塞的冠状动脉管腔，从而改善心肌血流灌注和阻止梗死面积扩大，是治疗缺血性心脏病的基本原则和有效方法[1]。然而心肌恢复血流过

程会造成缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，使治疗效果减弱甚至加

重心肌梗死[2]，因此I/R损伤的发生机制一直是心脏保护研究领域的重点和难点。目前导致心肌I/R损伤的途径尚不清楚，一般认为可能与以下机制有关：(1)细胞

自噬(autophagy)，自噬在缺血缺氧等应激状态下能维持细胞的存活，但是过分激活会损伤细胞，目前研究充分表明I/R特别是再灌注期间自噬上调会损伤心肌细胞[3-4]；(2)细胞焦亡(pyroptosis)，当心肌细胞发生I/R时，激活活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)系统和炎症反应，从而引起细胞的焦亡损伤[5]；

(3)细胞凋亡(apoptosis)，在啮齿动物心肌I/R模型中，观察到细胞凋亡在再灌注

后显著增加[6]。但是细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡等不同途径在I/R心肌损伤

过程中是否同时发生未见报道，本研究建立人心肌AC16细胞的缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)细胞模型，探讨不同复氧时间细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡的作用，以期深入揭示I/R心肌损伤的发病过程和分子机制，从而为缺血性心脏病防治提供依据。

材料和方法

1 细胞及实验试剂

人心肌AC16细胞株购自ATCC。低糖DMEM培养基(HyClone)；无糖DMEM

培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA和PBS(Gibco)；CCK-8试剂盒、细胞裂解液、ECL发光试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京碧云天生物技术研究所)；兔抗人LC-3、caspase-1、cleaved gasdermin D、cleaved caspase-3、Bax、Bcl2和α-tubulin多克隆抗体(CST)。

2 方法

2.1 细胞培养及实验分组采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞，

每3 d更换1 次培养基，取3～5代生长良好的AC16细胞用于实验。将细胞随机分为5组：空白对照(normal control, N)组，未做任何处理；缺氧组(0 h组)，无糖、无血清培养基培养细胞并置于37 ℃、含1% O2的培养箱中缺氧处理24 h；3个缺氧复氧组，缺氧处理后将培养基换成含10%胎牛血清的低糖DMEM，置于37 ℃、21% O2条件下分别复氧处理2 h(2 h组)、6 h(6 h组)和12 h(12 h组)。

2.2 CCK-8法检测心肌细胞活力每组AC16细胞设置6个复孔，每孔加入含10

μL CCK-8的培养基100 μL，并设置调零孔，置于37 ℃培养箱孵育2 h。450

nm 波长处检测细胞液的吸光度(A)值，实验重复3次。

2.3 Western blot法检测相关蛋白的水平细胞分组处理后，用RIPA裂解液提取

细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度。90 ℃使蛋白变性，取相同质量蛋白上样，进行SDS-PAGE， 60 V、60 min和90 V、60 min条件下电泳，结束后用湿转

法90 V、120 min将蛋白从凝胶上转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，加I 抗4 ℃摇床孵育过夜(LC-3 1∶1 000、caspase-1 1∶500、cleaved gasdermin D 1∶500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl2 1∶1 000和α-tubulin 1∶1 000)。相应的HRP标记 II抗(1∶2 000)常温孵育1 h，用TBST 洗

膜5次，每次5 min,ECL 发光，显影，Tanon 5200成像系统检测目的蛋白并拍照，ImageJ软件分析目的蛋白灰度值。

3 统计学处理