缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究

缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究DAI Wen-zhi;YE Wen-feng;HE Yuan;CHEN Can;HUANG Shi-an;LEI Wei;GUO Jun【摘要】目的:探讨缺氧复氧条件下不同复氧时间致心肌细胞损伤的途径.方法:培养人心肌AC16细胞,先置入1％O2、无糖无血清条件下培养24 h,再更换含10％胎牛血清的低糖DMEM联合21％O2进行不同时间的复氧培养,采用CCK-8法检测细胞活力,并通过Western blot法检测不同细胞损伤途径标记分子的蛋白水平,如细胞自噬相关蛋白LC3-II/-I、细胞焦亡相关蛋白caspase-1和gasdermin D 及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl2.结果:与空白对照组相比,各缺氧复氧组细胞活力降低,且随复氧时间延长,细胞活力相应持续降低(P<0.05),同时缺氧组LC3-II/-I上调(P<0.05),而复氧后LC3-II/-I较缺氧组下降,但仍高于对照组;此外,cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白在复氧6 h组和复氧12 h 组表达水平上调(P<0.05);cleaved caspase-3水平和Bax/Bcl2在复氧12 h组上调(P<0.05).结论:缺氧致心肌AC16细胞的自噬上调,并随复氧时间增加自噬水平减弱,且在复氧过程中细胞焦亡的激活早于细胞凋亡.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)007【总页数】4页(P1232-1235)【关键词】缺氧复氧;心肌细胞;细胞自噬;细胞焦亡;细胞凋亡【作者】DAI Wen-zhi;YE Wen-feng;HE Yuan;CHEN Can;HUANG Shi-an;LEI Wei;GUO Jun【作者单位】;;;;;;【正文语种】中文【中图分类】R363.2;R541.4缺血性心脏病是心血管系统中致死率和致残率最高的疾病之一，临床使用经皮冠状动脉介入术疏通狭窄甚至闭塞的冠状动脉管腔，从而改善心肌血流灌注和阻止梗死面积扩大，是治疗缺血性心脏病的基本原则和有效方法[1]。

然而心肌恢复血流过程会造成缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，使治疗效果减弱甚至加重心肌梗死[2]，因此I/R损伤的发生机制一直是心脏保护研究领域的重点和难点。

目前导致心肌I/R损伤的途径尚不清楚，一般认为可能与以下机制有关：(1)细胞自噬(autophagy)，自噬在缺血缺氧等应激状态下能维持细胞的存活，但是过分激活会损伤细胞，目前研究充分表明I/R特别是再灌注期间自噬上调会损伤心肌细胞[3-4]；(2)细胞焦亡(pyroptosis)，当心肌细胞发生I/R时，激活活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)系统和炎症反应，从而引起细胞的焦亡损伤[5]；(3)细胞凋亡(apoptosis)，在啮齿动物心肌I/R模型中，观察到细胞凋亡在再灌注后显著增加[6]。

但是细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡等不同途径在I/R心肌损伤过程中是否同时发生未见报道，本研究建立人心肌AC16细胞的缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)细胞模型，探讨不同复氧时间细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡的作用，以期深入揭示I/R心肌损伤的发病过程和分子机制，从而为缺血性心脏病防治提供依据。

材料和方法1 细胞及实验试剂人心肌AC16细胞株购自ATCC。

低糖DMEM培养基(HyClone)；无糖DMEM培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA和PBS(Gibco)；CCK-8试剂盒、细胞裂解液、ECL发光试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京碧云天生物技术研究所)；兔抗人LC-3、caspase-1、cleaved gasdermin D、cleaved caspase-3、Bax、Bcl2和α-tubulin多克隆抗体(CST)。

2 方法2.1 细胞培养及实验分组采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞，每3 d更换1 次培养基，取3～5代生长良好的AC16细胞用于实验。

将细胞随机分为5组：空白对照(normal control, N)组，未做任何处理；缺氧组(0 h组)，无糖、无血清培养基培养细胞并置于37 ℃、含1% O2的培养箱中缺氧处理24 h；3个缺氧复氧组，缺氧处理后将培养基换成含10%胎牛血清的低糖DMEM，置于37 ℃、21% O2条件下分别复氧处理2 h(2 h组)、6 h(6 h组)和12 h(12 h组)。

2.2 CCK-8法检测心肌细胞活力每组AC16细胞设置6个复孔，每孔加入含10μL CCK-8的培养基100 μL，并设置调零孔，置于37 ℃培养箱孵育2 h。

450nm 波长处检测细胞液的吸光度(A)值，实验重复3次。

2.3 Western blot法检测相关蛋白的水平细胞分组处理后，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度。

90 ℃使蛋白变性，取相同质量蛋白上样，进行SDS-PAGE， 60 V、60 min和90 V、60 min条件下电泳，结束后用湿转法90 V、120 min将蛋白从凝胶上转移到PVDF膜上。

5%脱脂牛奶封闭1 h，加I 抗4 ℃摇床孵育过夜(LC-3 1∶1 000、caspase-1 1∶500、cleaved gasdermin D 1∶500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl2 1∶1 000和α-tubulin 1∶1 000)。

相应的HRP标记 II抗(1∶2 000)常温孵育1 h，用TBST 洗膜5次，每次5 min,ECL 发光，显影，Tanon 5200成像系统检测目的蛋白并拍照，ImageJ软件分析目的蛋白灰度值。

3 统计学处理应用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

结果1 缺氧复氧后心肌AC16细胞活力下降与空白对照组比，缺氧组细胞活力下降(P<0.01)，复氧2 h组、复氧6 h组和复氧12 h组的细胞活力均比缺氧组进一步降低(P<0.05)，且复氧6 h组比复氧2 h 组的细胞活力低，但随着复氧时间延长至12 h，其细胞活力与复氧6 h组相比差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The cell vitality from each group determined by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs N group; #P<0.05， ##P<0.01 vs 0 h group. 图1 CCK-8法测定各组细胞的活力2 AC16细胞自噬随复氧时间延长而减弱与空白对照组比，缺氧组、复氧2 h组、复氧6 h组和复氧12 h组的AC16细胞LC3-Ⅱ/-I比值增加，表明细胞自噬水平显著上调(P<0.01)。

然而，与缺氧组AC16细胞相比，复氧6 h组和复氧12 h组细胞自噬水平则显著下降(P<0.05)，见图2。

3 缺氧复氧后心肌 AC16细胞发生焦亡与空白对照组相比，缺氧组AC16细胞的pro-caspase-1蛋白表达量显著上调(P<0.05)，但cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D未见明显变化。

当复氧6 h和12 h时，AC16细胞的焦亡相关蛋白cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白水平均显著增加(P<0.05)，从而提示缺氧复氧6 h后AC16心肌细胞焦亡被激活，见图3。

4 缺氧复氧致心肌 AC16细胞凋亡缺氧及复氧处理2 h和6 h后，AC16细胞的凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达量和Bax/Bcl2比值与空白对照组相比差异无统计学显著性，当复氧处理12 h 后，cleaved caspase-3表达量和Bax/Bcl2 比值明显上调(P<0.05)，说明此时心肌 AC16细胞启动凋亡程序，见图4。

Figure 2.The LC3-Ⅱ/-Ⅰ ratio in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mea n±SD. n=3. **P<0.01 vs N group;#P<0.05, ##P<0.01 vs 0 h group.图2 缺氧复氧处理后AC16细胞LC3-Ⅱ/-I变化Figure 3.The protien levels of pro caspase-1, cleaved caspase-1 and cleaved gasdermin D in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different tmes. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs N group; #P<0.05, ## P<0.01 vs 0 h group.图3 缺氧复氧处理后AC16细胞pro-caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D的蛋白水平比较讨论缺血再灌注对心肌细胞造成严重损伤，再灌注过程中发生的细胞自噬、细胞焦亡、细胞凋亡与心肌梗死面积大小和心梗后左心重塑密切相关[7-9]，揭示细胞损伤途径在不同再灌注时间的启动时间和状态，有利于探讨更有效的心肌保护方法。

AC16细胞是来源于人胚胎的心肌细胞，不能发生搏动，但与人心肌细胞有相似的功能和特性。

本研究采用心肌 AC16细胞建立缺氧复氧模型，模拟人体心肌缺血再灌注过程，并设置不同的复氧时间，来探讨不同复氧时间细胞自噬、焦亡和凋亡的激活状态。

研究发现随着复氧时间延长细胞活力下降，证实复氧会对心肌细胞造成剧烈损伤。

而观察不同复氧时间心肌细胞状态，发现缺氧组心肌细胞自噬水平升高，复氧时间增加时自噬水平下降，但与空白对照组相比，细胞自噬水平仍处于较高程度。

因此缺氧诱导心肌细胞自噬，复氧则抑制自噬。

Sandanger等[10]提出细胞焦亡在小鼠缺血再灌注后的心肌组织中被上调，然而本研究发现缺氧并不会引起细胞焦亡的发生，仅在复氧6 h后启动细胞焦亡，但细胞凋亡出现在复氧12 h，从而表明在缺氧复氧过程中心肌 AC16细胞焦亡早于凋亡，且复氧12 h后细胞开始遭受多途径的复合损伤。