N 病毒毒力测试实验

毒力测试技术路线
前言:
虫媒病毒（Arbovirus ）是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病，因此虫媒病毒可以引起人畜共患传染病（1）。

套式病毒（Nidoviruses ）包括了冠状病毒（Coronaviridae ）和动脉炎病毒（Arteriviridae ）及罗尼病毒（Roniviridae ），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和
较长基因组（12.7~31.7bp）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒（2）。

国内，深圳市龙岗区疾控中心开展了虫媒监测项目，从医院监测点捕获的成蚊标本中首次发现昆虫套式病毒NDiV，并应用C6/36细胞成功地分离到NDiV 病毒，是目前国内对NDiV的研究仅有这一篇报道（3）。

国外,2011年，mBio报道了首篇昆虫套式病毒的研究（4），在科特迪瓦的原始森林的库蚊中首次发现了昆虫套式病毒，命名为Cavally virus（CA VV）。

同年，PlOS Pathogens刊登（5）同为昆虫套式病毒的研究，病毒于2002年在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离成功（6），在当地库蚊标本也分离得到，作者Phan Thi Nga 根据病毒的分离地点将其命名为Nam Dinh Virus（NDiV）。

由于NDiV和CA VV 的宿主与分子特性相似，与套式病毒中的已有家族存在差异，故Phan Thi Nga 将其归类为Nidoviruses的新家族，命名为Mesoniviridae（7）。

传统意义的套式病毒（Nidoviruses）包括冠状病毒（Coronaviridae）、动脉炎病毒（Arteriviridae）及罗尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7kb）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒。

在科特迪瓦与越南发现的昆虫套式病毒填补了套式病毒存在于节肢动物的空白。

目前最长的单股正链ssRNA+节肢动物病毒，NDiV 与CA VV核酸序列长度约为20.2kb，这显示它们可能是套式病毒中如猪生殖与呼吸综合征病毒的短基因病毒（small genomes）与SARS冠状病毒的长基因病毒（large genomes）之间的进化连接。

目前，国外关于NDiV的研究报告仅有Phan Thi Nga发表的两篇论文（5,7），国内的研究报告有“中国国内首次发现Nam Dinh 病毒”。

研究程度只涉及病毒的分子结构学领域。

虽然该病毒曾在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离得到，但尚未有具体的病理因果证据证明该病毒的致病性。

NDiV是否为新的虫媒病毒仍然需要进行深入的研究与论证，后续研究将有助于我国新分离虫媒病毒的致病性的研究，对探讨病毒与人类疾病的关系，对新发病毒的危害作出更客观的评估。

NDiV毒力测试实验步骤：
1．1 NDiV 乳鼠脑病毒悬液制备与保存
1~2 日龄健康乳鼠（昆明品系），脑内接种NDiV C6/36 细胞病毒悬液
0.02mL/只，在有纱窗设备的动物房中饲养。

逐日观察乳鼠是否发病（如出现散窝、抽搐、弓背等症状），于濒临死亡时无菌解剖取出鼠脑。

加无血清的DMEM 培养液在冰浴中研磨成浆，12,000rpm 离心10min，冻存管分装，液氮冻存备用。

1.2 NDiV 病毒株的获取途径（8）
1.2.1 NDiV 病毒在细胞中传代
利用C6/36细胞，模拟自然界中NDiV病毒在宿主C6/36细胞中传代，同时在C6/36细胞中连续传代。

用已定量的病毒采用高感染复数(MOI)＜0.01的病毒悬液分别接种C6/36，逐日观察细胞病变情况，当CPE达到最佳时，冰冻于-30℃冰箱中破裂细胞，然后放置37℃环境下解冻，低速离心，通过0.22μm的过滤器过滤，收集上清液感染下一代细胞，如此培养数代细胞病毒。

余下的上清液标记编号置于-70冰箱冻存备用。

1.2.2 NDiV病毒滴度的测定（9）
根据传统的空斑形成试验测定方法，将上述收集的病毒悬液采用空斑法进行病毒滴度测定。

首先在12 孔培养板内常规制备BHK21和C6/36单层细胞。

在冰浴中，将每代细胞病毒上清液用细胞维持液作10倍稀释（10-1至10-8），接种各稀释度的病毒悬液，每个稀释度接种各2孔，每孔0.4mL，摇动12孔板，使布满细胞层。

置于37℃吸附1.0 h，每隔15min摇动一次，使病毒充分吸附。

吸出孔内液体，加2%琼脂糖覆盖胶，每孔3.0 （1.5）mL，室温下待覆盖胶凝固，然后细胞面朝上，置37℃孵箱中培养6-7 d。

直接加入4%甲醛固定30min 后，自来水冲洗，加入1%的结晶紫或者中性红染液染色10min，自来水冲洗晾干，开始观察计数空斑数，按公式计算空斑形成单位。

空斑形成单位（PFU/mL）＝每孔平均空斑数（PFU）×病毒稀释倍数÷每孔病毒接种量（mL）
1.2.3 NDiV病毒荧光定量PCR 标准品的制备：
按照RNA提取试剂盒说明书提取NDiV病毒鼠脑悬液的RNA，吸取病毒鼠脑悬液200μL加入Trizol 500μL，再经过氯仿分离、异丙醇沉淀、冰乙醇洗涤等步骤提取RNA，20μL DEPC 处理水溶解后反转录为cDNA，并用上述引物扩增目的基因，片断大小为128 bp，PCR 反应条为：94 ℃ 5 min，94℃30 s，
58 ℃3 0 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，4℃保存，40个循环。

反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。

而后用胶回收试剂盒对PCR 产物进行回收，回收产物连接载体，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落进行PCR和测序检测，鉴定测序结果与原核酸序列高度同源后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定质粒浓度，作为标准质粒，按如下公式计算标准质粒拷贝数：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（MWg/mol）（10）。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测病毒在C6/36细胞中的动态变化
按照RNA 提取剂盒说明书提取上述不同时间收集的细胞上清病毒RNA，阳性质粒标准品用作为阳性对照，用前述建立的荧光定量PCR 方法检测病毒增殖量，用仪器自带软件分析增殖量的动态变化，PCR 扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳验证。

构建病毒在C6/36细胞中不同时间段的病毒复制曲线。

1.3 NDiV病毒对小鼠的致病性与半数致死量（LD50）测定（11）
1.3.1 NDiV 病毒对小鼠的LD50测定
领取体重1~2日龄健康乳鼠5窝（40只），按体重随机分为9个剂量组，每组4只，其中第9组为对照组，给予不含病毒的2% FBS DMEM 培养液，其余各组的病毒以10倍递次稀释成10-1至10-8或100至10-6，每个稀释度分别接种4 只小鼠，每只脑内注射0.03mL，在有纱窗设备的动物房中饲养。

逐日观察乳鼠发病症状，记录各组乳鼠的死亡数与时间。

按Reed 和Muench 氏法计算LD50。

LD50的计算：
高于50%的死亡分数-50%
距离比例= ────────────────────
高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数
LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
1.4 NDiV病毒对鸡致病性实验（12）
1.4.1 NDiV病毒的SPF鸡胚EID50的测定
将Nidoviruses毒种做10 倍系列稀释，取10-1至10-8分别卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各10枚，0.2 mL/枚。

37℃孵育（48h 内死亡者弃去，不入记录）
至正常出雏日后第3日，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏鸡数及有禽脑脊髓炎特异性症状(如头颈震颤或麻痹、运动失调等)的发病雏鸡数，按Reed-Muench 法计算EID50。

同时设6日龄SPF鸡胚10枚，卵黄囊接种灭菌生理盐水，0.2mL/胚，作对照鸡胚，应至少8枚按时出雏。

1.4.2 NDiV病毒对雏鸡的毒力试验
将毒种稀释至100 EID50，分别通过脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种1日龄SPF鸡各10只，0.1mL/只，观察28日。

每日记录出现AE症状的鸡数（病雏症状有：发育不良，精神不振、易惊，半蹲姿势，重者头颈震颤、运动失调，瘫痪等）。

同时设10只SPF鸡对照，分别脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种稀释液0.1mL/只，在同等条件下饲养，观察28日，应不发病。

1.4.3 鸡胚平均死亡时间(MDT)试验
新收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水10倍倍比稀释后,接种10日龄SPF鸡胚,每个稀释度接种6枚鸡胚,0.2mL/枚,并设生理盐水对照组,35°C孵育7d。

定时照胚并记录鸡胚死亡数量和死亡时间,收集尿囊液测定血凝价。

使所有鸡胚死亡的最高稀释倍数为病毒的最小致死剂量,MDT是最小致死剂量使鸡胚死亡平均时间,具体计算如下：
Xh死亡胚数x Xh+YH死亡胚数x YH
MDT = ────────────────────
死亡总胚数
参考文献:
[1] 梁国栋.虫媒病毒研究进展[C].国内外医学科学进展，1999.62- 68.
[2] Gorbalenya A E，Enjuanes L，Ziebuhr J，et al. Nidovirales：evolving the largest RNA virus genome [J] . Virus Res，2006，117：17-37.
[3] 刘渠，林琳，周健明，等.中国国内首次发现Nam Dinh 病毒[J].病毒学报，2013，29（1）.
[4] Florian Z，Andreas K，Phenix-Lan Q，et al. An Insect Nidovirus Emerging from
a Primary Tropical Rainforest [J].mBio，2011，2（3）：1-10.
[5] Phan T N，Maria del C P，Chris L，et al. Discovery of the first insect nidovirus，
a missing evolutionary link in the emergence of the largest RNA virus genomes [J].
PLoS P，2011，7（9）：1-18.
[6] Phan T N，Nguyen T T，Komichi M，et al. Emerging viruses associated with acute encephalitis syndrome in vietnam[A]. Scientific conference of the institut pasteur international network：emerging and re-emerging viral infections[C]. National Institute of Hygiene and Epidemiology Hanoi，2006.
[7] Chris Lauber，John Ziebuhr，Sandra Junglen，et al.Mesoniviridae: a proposed new family in the order Nidovirales[J]. Arch Virol，2012，157：1623-1628.
[8]朱小娟. 登革病毒在宿主选择压力下基因组核苷酸变异与毒力的相关研究[D].安徽医科大学,2013.
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山西农业大学报, 30(4): 332-335.
[11]刘欣玉,俞永新,李茂光,徐宏山,王环宇,梁国栋,贾丽丽,董关木. 我国新分离乙型脑炎病毒株毒力特征研究[J]. 病毒学报,2008,06:427-431.
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