新一代测序技术的原理

Klenow (3’exo- ) and dATP
5’po4 3’A A3’ po45’ 3’ 5’po4 3’T 5’ P7反向互补序列 3’
+
3.Ligation of adaptors
5’ DNA insert
SBS oligo
5’
3’
P7 P5 SBS oligo
5’
PCR enrichment
1950
1960
1970
1980
1990
2000
2010
Chemical degradation method by Whitfield (1954)
Development of Sanger Sequencing (1977)
Invention of Capillary Sequencer (1996) Invention of Automated Fluorescent Sequencer (1985) Invention of 454 GS 20 Sequencer (2005)
由此诞生了以Sanger命名的测序原
理即双脱氧链终止法测序原理。
核酸序列形成的基础
O P O OH CH2 H H OH O H H （H） OH H OH N OH O
2 3´,5´ -CH 磷酸二 O 酯键
O P OH OH
O P O OH CH2
N H H （H） OH
OH
O H H
N H
H
Solexa是一种基于边合成边测序技术 (Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型 测序方法。通过利用单分子阵列实现在 小型芯片(Flow Cell)上进行桥式PCR反应。 由于新的可逆阻断技术可以实现每次只 合成一个碱基，并标记荧光基团，再利 用相应的激光激发荧光基团，捕获激发 光，从而读取碱基信息。
Next-generation sequencing technology overview
Agenda
• • • • 测序技术简史 第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术
1 测序技术简史
chemical degradation method by MaxamGilbert method (1977) Invention of Heliscope single molecular sequencer
单向测序
Paired-End Sequencing
双向测序
Indexed Sequencing
混合样品测序 这三种测序类型的文库构建大体一致，主要区别在于接头。
Single-Read Sequencing
Fragment DNA
5’ 3’ 5’ + 5’ 3’ 5’ 5’ + 3’ 3’ 5’
1
2 3
4
5
6
7
8
9
TTTTTTTGT…
3.3 测序
• Paired-End Sequencing (PE, 双向测序)和 Indexed Sequencing
Single Read
Paired End
OH
OH
U
U U U U U U
P7
P5
Grafted flowcell
Template Hybridization
如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释 放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的
ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号 由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺
1
文库制备
DNA打断 末端修复 加A 加接头 纯化
2
制备芯片
模板杂交 桥式PCR扩增 测序引物准备测序
3
测序
测序 生成 base calls
4
数据分析
拍照图片 Intensities Reads Alignments
3.1 文库制备 Solexa有三种不同的测序种类： Single-Read Sequencing
P7
Insert Cluster template
Paired-End Sequencing Indexed Sequencing
混合样品测序 双向测序
3.2 芯片制备和测序
• Cluster 生成步骤:
– – – – – 固定 扩增 线性化 阻断 引物杂交
Cluster 生成化学步骤
cBOT
1.End repair
T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment)
SBS oligo
P7 反向互补序列
Phosphorylation T4 polynucleaotide kinase, ATP
5’po4 3’ 3’ po45’
2.Add 3’ Adenosine with
Birthday Principle Pyrosequencing
Roche 454
2005
Genome Analyzer/ Hiseq 2000
2006
Sequencing-bySynthesis
ABI SOLiD
2007
Sequencing-byLigation
2 Hiseq 2000（Solexa）测序原理
n=35 总数
1st cycle 延长
2nd cycle 变性
diol
diol
diol
diol
diol
diol
2nd cycle 延长
2nd cycle 退火
OH
OH
diol
OH
diol
NaIO4
OH
Cluster 扩增完成
线性化
用ddNTP () 阻断
Primer 加测序引物
Y
X
TGCTACGAT…
3’
P7
5’
P7 反向互补序列
3’
1st round PCR
5’ 3’ 3’ 5’
5’
3’
3’
3’
5’
P7
P5 SBS oligo P7 反向互补序列
PCR enrichment (cont.)
3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’
SBS oligo
P5
5’ 3’
2nd round PCR
3’ 5’
z=universal bases
SOLiD的特点
• 通量大 • 成本低 • 序列短
– Ligase的方式虽然能一定程度避免phasing/prephasing，但增加的复杂度也降低了效率
• 灵活性差，对小数据量测序不适用 • Two-base coding
Next-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms
H O P O
5´磷酸
O
O P OH OH
（H） OH
O
3´羟基
N H H
OH CH2 H H OH O H H OH （H） N
CH2 H H OH
O
（H） OH
核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图
“双脱氧末端终止”的含 义
终止物标记方法
Template
dNTP
Primer
Polymerase
Roche 454
2005
Genome Analyzer/ Hiseq 2000
2006
Sequencing-bySynthesis
ABI SOLiD
2007
Sequencing-byLigation
454测序原理
测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，
依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。
Terminator
A C G T
因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。
3730xl Sequence Map
Next-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms
Birthday Principle Pyrosequencing
Invention of Applied Biosystems Solid System (2007)
Invention of Illumina Genome Analyzer System (2006)
1977年，英国人Fred Sanger 发现，
如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会
产生一系列末端终止的DNA链，并能通过 电泳按长度分辨。 不同末端终止DNA链的长度是由掺入 到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。
Invention of Single molecule real time(SMRT) DNA sequencing
Invention of personal genome machine
Invention of optical mapping system
Invention of Nanopore single molecular sequencing (Oxford Nanopore corporation)
n=25 total
U
U
U
U
U
U
2nd cycle extension 延长
2nd cycle annealing 退火
U
U
Cluster Amplification 扩增后的簇
Initial extension
Denaturation
芯片上的接头
模板杂交
第一链的延长
变性
U
U
U
U
U
U
U
U
1st cycle denaturation 变性
1st cycle annealing 退火
1st cycle extension 延长
2nd cycle denaturation 再变性
可逆阻断技术
3’5’-
…-5’
G T A T T T T C G G C A C A G A C T C T G T
G
A
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
3 Hiseq 2000测序技术流程
Birthday Principle Pyrosequencing
Roche 454
2005
Genome Analyzer/ Hiseq 2000
2006
Sequencing-bySynthesis
ABI SOLiD
2007
Sequencing-byLigation
n=degenerate bases
主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列
中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，
而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造
成结果不准确。因此454技术主要的错误不是来自核苷酸 的替换，而是来自插入或缺失。
Next-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms
3. 测序
将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进 行测序。 PTP板上含有很多直径约为44 μm的小孔，每个小孔仅能 容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监
测接下的测序反应。
454的特点
较高的测序通量，每个循环能产生总量为400-600 Mb的序 列。 提高测序读长，长度达到400 bp，使得后继的序列拼接工 作更加高效、准确。
入的核苷酸数目成正比。
反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并 再生反应体系。
454测序流程
1. 待测DNA文库的构建
将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继 的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到 DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA 片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被
出样孔
进样孔
• Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)
OH
diol
diol
diol
diol
diol
diol
diol
Flow Cell接头
P7
P5
模板杂交
延长
变性
diol
diol
diol
diol
diol
diol
diol
diol
1st cycle 变性
1st cycle 退火
洗脱掉，片段AB\BA\BB结合到磁珠上，通过变性处理回
收含有接头A和接头B的单链DNA。
2.
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ

Emulsion PCR 将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28 μm的磁珠在一 起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序 列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。 同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠 结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍可 以结合到磁珠上。 反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增 反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步 测序反应所需的模板量。