微生物学检验(第3版)结核杆菌

3000rpm/min离心30 min，弃上清液，
取沉淀物涂片做抗酸染色；
②漂浮集菌法：取晨痰2~3ml放入100ml三
角烧瓶内，加入1~2倍量40g/L NaOH溶液， 经高压灭菌20min（或煮30 min）。冷却后 滴汽油0.3 ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶 口置震荡器或手摇震荡10 min ，再加蒸馏水 至满瓶口而不外溢，静置10~15 min，将洁 净载玻片盖在瓶口上，静置15~20 min，取 下载玻片并迅速将载玻片翻转置浸膜向上， 自然干燥，火焰固定后做抗酸染色，用油镜 检查。
三、步骤和方法
1、标本接种
1)标本处理
酸处理法：取痰标本1~2ml于无菌试管内，
加2% H2SO4 溶液2~4倍量混匀后置室温放置 30min，在此期间震荡痰液2~3次，使痰液化， 离心取沉淀物接种。
碱处理法：取痰标本1~2ml于无菌试管
内，加入40g/L NaOH溶液2~4倍量后置
4+：斜面上菌落生长密集成菌苔。
形态观察

涂片 0.01ml脓性痰或干酪样部分痰液，制成 10mm×10mm 大小的均匀薄涂片，或取上 述标本约0.1ml ，制成20mm×15mm大小的 厚膜涂片。自然干燥，火焰固定后，行抗酸 染色，用油镜检查。
直接涂片和厚膜涂痰液2~3ml，40g/L NaOH 1~2倍量混匀。经高压灭菌 20min（或煮30 min），

结核分枝杆菌在L—J培养基菌落为干燥、 粗糙、颗粒状、乳白色或米黄色、凸起、形似 菜花心或粟米粒。于接种1周内观察2次，以后 每周观察1次细菌生长情况，注意菌落形态、 数量、色泽变化和出现菌落的时间等 。
斜面上生长的菌落在20个以下，应报告菌落
数；若多于20个菌落数以“+”表示，具体报 告见下： 1+：斜面上生长20个菌落以上，占斜面1/4以 下； 2+：斜面上菌落生长面积占斜面1/4以上， 1/2以下； 3+：斜面上菌落生长面积占斜面1/2以上， 3/4以下；
结核分枝杆菌 检验技术
一、目的要求
1. 掌握结核分枝杆菌形态、抗酸染 色的操作与结果报告方法。
2.熟悉结核分枝杆菌的培养特性和
常用鉴定方法。
二、器材和试剂
1. 菌种 结核分枝杆菌。
2.
培养基 改良罗氏培养基。
3.
4.
试剂
抗酸染色液、消佳净消毒液。
其他 肺结核患者痰标本，载玻片，显 微镜，香柏油，酒精灯，接种环，火柴等。
抗酸染色
原理 ：抗酸性菌体内含脂类物质较多，此物质 具有抗酸的性质。染色时，它与石炭酸复红 结合牢固，能抵抗酸性酒精的脱色作用，同 时脂类又不易透过细胞膜，不能被脱色，因 此抗酸菌能保持复红的颜色。而非抗酸性菌 体内含脂类少，易被酸性酒精脱色，脱色时 又易从细胞膜渗出而脱掉，最后被美兰复染 成蓝色。
主要组成成分
Ｒ１：石炭酸复红液
Ｒ２：高锰酸钾溶液
Ｒ３：盐酸酒精液 Ｒ４：碱性美兰液
检验方法：
涂片 ，自然干燥，火焰固定
Ｒ２各2滴覆盖标本 复染10-30秒 水洗 2分钟
冷却后加Ｒ１、
水洗 用Ｒ４1-2滴
用Ｒ３脱色至无色为止，水洗
干燥，镜检。
结果判定
（-）未发现抗酸菌/300个油镜视野 （±）1~2个抗酸菌/300个油镜视野 （ + ）3~9个抗酸菌/100个油镜视野 （ ++ ）10~99个抗酸菌/100个油镜视 （ +++ ）1~10个抗酸菌/每个油镜视 （ ++++ ） >10个抗酸菌/每个油镜视野
370C孵育箱放置30min，期间震荡痰液
2~3次，使痰液化，离心取沉淀物接种。

接种与培养：取消化后的痰液0.1ml均
匀接种于罗氏培养基斜面上，每份标本
接种2支培养基，将试管150角斜置，
370C孵箱培养1周后将培养基直立于试 管架上，继续培养至8周。初次分离培 养需要5%~10%CO2。
菌落观察与结果报告：
报告方式
1.未找到抗酸杆菌 2.找到抗酸杆菌（+/++/+++/++++）