微生物学检验(第3版)结核杆菌

结核分枝杆菌在L—J培养基菌落为干燥、 粗糙、颗粒状、乳白色或米黄色、凸起、形似 菜花心或粟米粒。于接种1周内观察2次，以后 每周观察1次细菌生长情况，注意菌落形态、 数量、色泽变化和出现菌落的时间等 。
斜面上生长的菌落在20个以下，应报告菌落
数；若多于20个菌落数以“+”表示，具体报 告见下： 1+：斜面上生长20个菌落以上，占斜面1/4以 下； 2+：斜面上菌落生长面积占斜面1/4以上， 1/2以下； 3+：斜面上菌落生长面积占斜面1/2以上， 3/4以下；
370C孵育箱放置30min，期间震荡痰液
2~3次，使痰液化，离心取沉淀物接种。

接种与培养：取消化后的痰液0.1ml均
匀接种于罗氏培养基斜面上，每份标本
接种2支培养基，将试管150角斜置，
370C孵箱培养1周后将培养基直立于试 管架上，继续培养至8周。初次分离培 养需要5%~10%CO2。
菌落观察与结果报告：
结核分枝杆菌 检验技术
一、目的要求
1. 掌握结核分枝杆菌形态、抗酸染 色的操作与结果报告方法。
2.熟悉结核分枝杆菌的培养特性和
常用鉴定方法。
二、器材和试剂
1. 菌种 结核分枝杆菌。
2.
培养基 改良罗氏培养基。
3.
4.
试剂
抗酸染色液、消佳净消毒液。
其他 肺结核患者痰标本，载玻片，显 微镜，香柏油，酒精灯，接种环，火柴等。
4+：斜面上菌落生长密集成菌苔。
形态观察

涂片 0.01ml脓性痰或干酪样部分痰液，制成 10mm×10mm 大小的均匀薄涂片，或取上 述标本约0.1ml ，制成20mm×15mm大小的 厚膜涂片。自然干燥，火焰固定后，行抗酸 染色，用油镜检查。
直接涂片和厚膜涂片：用接种环挑取约

集菌涂片： ①沉淀集菌法：取痰液2~3ml，40g/L NaOH 1~2倍量混匀。经高压灭菌 20min（或煮30 min），
报告方式
1.未找到抗酸杆菌 2.找到抗酸杆菌（+/++/+++/++++）
3000rpm/min离心30 min，弃上清液，
取沉淀物涂片做抗酸染色；
②漂浮集菌法：取晨痰2~3ml放入100ml三
角烧瓶内，加入1~2倍量40g/L NaOH溶液， 经高压灭菌20min（或煮30 min）。冷却后 滴汽油0.3 ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶 口置震荡器或手摇震荡10 min ，再加蒸馏水 至满瓶口而不外溢，静置10~15 min，将洁 净载玻片盖在瓶口上，静置15~20 min，取 下载玻片并迅速将载玻片翻转置浸膜向上， 自然干燥，火焰固定后做抗酸染色，用油镜 检查。
三、步骤和方法
1、标本接种
1)标本处理
酸处理法：取痰标本1~2ml于无菌试管内，
加2% H2SO4 溶液2~4倍量混匀后置室温放置 30min，在此期间震荡痰液2~3次，使痰液化， 离心取沉淀物接种。
碱处理法：取痰标本1~2ml于无菌试管
内，加入40g/L NaOH溶液2~4倍量后置
主要组成成分
Ｒ１：石炭酸复红液
Ｒ２：高锰酸钾溶液
Ｒ３：盐酸酒精液 Ｒ４：碱性美兰液
Hale Waihona Puke Baidu 检验方法：
涂片 ，自然干燥，火焰固定
Ｒ２各2滴覆盖标本 复染10-30秒 水洗 2分钟
冷却后加Ｒ１、
水洗 用Ｒ４1-2滴
用Ｒ３脱色至无色为止，水洗
干燥，镜检。
结果判定
（-）未发现抗酸菌/300个油镜视野 （±）1~2个抗酸菌/300个油镜视野 （ + ）3~9个抗酸菌/100个油镜视野 （ ++ ）10~99个抗酸菌/100个油镜视 （ +++ ）1~10个抗酸菌/每个油镜视 （ ++++ ） >10个抗酸菌/每个油镜视野
抗酸染色
原理 ：抗酸性菌体内含脂类物质较多，此物质 具有抗酸的性质。染色时，它与石炭酸复红 结合牢固，能抵抗酸性酒精的脱色作用，同 时脂类又不易透过细胞膜，不能被脱色，因 此抗酸菌能保持复红的颜色。而非抗酸性菌 体内含脂类少，易被酸性酒精脱色，脱色时 又易从细胞膜渗出而脱掉，最后被美兰复染 成蓝色。