琼脂糖凝胶电泳和SDSPAGE凝胶电泳2

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浓缩胶

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。
分离胶
孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以
使样品很好的分离.
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分离范围

SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰 胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔 径达到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰 胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相 差只有3% 的蛋白质。
常用的电泳缓冲液的配制
缓冲液 Tris—乙酸 （TAE） Tris—磷酸 （TPE） 使用液 1×：0.04moL/L Tris—乙酸 0.001moL/L EDTA 1×：0.09moL/L Tris—磷酸 0.002moL/L EDTA 浓贮存液（每升） 50×：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) 10×：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 5×：54g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)
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DNA片段长度标记
1. DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker, 2. 本实验使用MarkerIII，分别由200 bp、500 bp、800 bp、1200 bp、2000 bp、3000 bp和4500 bp的7条DNA 条带组成，DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片 段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。
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贮存温度 4℃
II
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室温
III
4℃
IV V （碱性加样缓冲液）
4℃ 4℃
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1. 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进 入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操 作更为便利。 2. 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF 的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
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TEMED

凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围 如下表：
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
丙烯酰胺浓度（%） 15 线性分离范围（kD） 12～43
10
7.5 5.0
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16～68
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四、跑出好看的电泳图
1. 凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清 澈不清澈 ； 2. 一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看 ； 3. 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； 4. 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应 ，中间 电场比较均匀 ； 5. 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； 6. 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内 ； 7. 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。
DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测
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采用不同浓度的凝胶可以分辨DNA分子的范围
凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离长度 200bp—近50kb 5—500bp 分辨率高
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一、实验原理
电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常
30% 丙烯酰胺
1.5M TrisHClPH8.8 10% SDS 10% AP
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2.7 ml
2 ml 100 μl 50 μl 5 μl
30% 丙烯酰胺
1 M TrisHClPH8.8 10% SDS 10% AP TEMED
0.67 ml
1 ml 50 μl 25 μl 5 μl
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分类
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连 续系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝 胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要 靠电荷和分子筛效应。
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电泳槽
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不连续系统

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
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3、用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙 醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用 DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。 4、在制胶槽中放好梳子。将融化的琼脂糖凝胶导入胶槽中。室温 冷却15-20min 5、将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固 15—20min。
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实 验 二
SDS-PAGE凝胶电泳
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SDS-PAGE凝胶电泳
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
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实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
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实验原理
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上样缓冲液 之二
注意事项
还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二 硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味， 较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和 健康，应穿实验服并戴一次性手套操作。
基本参数（北京六一）： 外型尺寸（L×W×H）：310×150×90mm 凝胶板规格(L×W)：60×60mm；120×60mm；60×120mm；120×120mm 试样格：11+25齿(1.0mm厚)；6+13齿,8+18齿(1.5mm厚)；2+3齿(2.0mm厚) 缓冲液总容量：约650ml 2016/1/17 13 重量：1Kg 2015/5/6
强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的
二硫键使这种结合更加充分。
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基本原理之二

结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的 大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。
基本原理 分类 分离范围
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四甲基乙二胺(TEMED) 丙烯酰胺
共聚合
激活作用
聚丙烯酰胺
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸胺(AP)
激活作用
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基本原理之一
阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间
及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
6、在凝胶完全凝固之后，小心垂直移去梳子，将胶床放在电泳槽 内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 7、向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。
8、分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入 加样孔。 9、正确连接电泳槽和电源，设定稳压为140V，电流一般为50mA。
36～94 57～212
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上样缓冲液之一
上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以 溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样 缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。
本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上 样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链 间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此 分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使 用时请务必注明，仔细区分。
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电泳缓冲液的组成
1. Tris—乙酸（TAE） 2. Tris—硼酸（TBE） 3. Tris—磷酸（TPE） 其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液 均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存 于室温。
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核酸染料
1. 溴化乙锭（EB）是一种为芳香族类染料，当DNA样 品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插 入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光 增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂 糖中的DNA。 2. Godview吖啶橙类核酸低毒染料目前尚未发现具有 致癌性。 3. Genegreen花青素母体为基础，苯环改良成链式结 构的油性大分子，目前认为的最低毒的核酸绿色染料。 备注：一般将核酸染料加入loading buffer中可以减少 污染及减少用量（1ml loading buffer ：10ul染料）。
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二、实验方法
1、50×TAE的稀释：如制备50mL 1×TAE，取1mL
50×TAE加入49mL水定容至50mL。
2、制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液 冷却至60℃。
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Tris—硼酸 （TBE）
0.5×0.045moL/L Tris—硼酸 0.001moL/L EDTA
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加样缓冲液
缓冲液类型 I 6×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 0．15%溴甲酚绿 0．25%二甲苯青FF
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含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量%(W/V)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2
DNA/RNA分子的分离范围(kb)
5—60 1—20 0.8—10 0.5—7 0.4—6 0.2—3 0.1—2
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胶的配制方法
活性胶 6% H2O 30% 丙烯酰胺 8 ml 4.2 ml 1.67 ml
1.5M TrisHClPH8.8
10% AP TEMED 变性胶 10% H2O 8 ml 3.2 ml
2.02 ml
100 μl 10 μl 浓缩胶 5% H2O 4ml (2 cm) 3.2 ml
用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的 多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将 向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架 两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。 当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加， 不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因 而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离
10、电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。
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三、注意事项与实验技巧
1. 2. 3. 4. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否 则样品渗漏或DNA带型不整齐。 5. 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很 小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。 6. 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板， 梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等； 相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、 酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制 胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。