实验酶联免疫吸附测定PPT参考课件
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酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
1
抗原-抗体反应的基本检测方法
凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。 补体参与的反应 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示 踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。
13
间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
鼠IgG(抗原)
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG
酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG
聚苯乙烯酶标板 水浴箱
移液器
枪头
免疫 兔抗小鼠IgG(一抗)
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS
2MH SO4终止反应 15
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔
37 ℃ 20min
抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 15min
EE
底物液100ul
→洗涤：3次，
1min/次
→ 洗涤：3次，
1min/次
→ 终止液50ul 终止液终止显色
18
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
科研服务
环境卫生
……
19
酶催化底物液显色
▪ DH2+ H2O2 E D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
▪ DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
20
酶 /E
辣根过氧化物酶 (HRP)
碱性磷酸酯酶 (AP) 葡萄糖氧化酶 (GOD) β-Ｄ－半乳糖苷 酶 (β-Gal)
竞争抑制法 （检测抗原）
待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
12
待检HBcAb 标准HBcAg
wash
wash
标准酶标 HBcAb
TMB
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；
2
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原 或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的 或可测定的。
3
免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
4
课程内容
▪ ELISA的原理 ▪ ELISA的分类 ▪ 间接ELISA的具体操作 ▪ ELISA在医学中的应用实例
5
酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)
37℃,20min ▪ 弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次 ▪ 加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（ 100μl/孔），以
200×起始，空白对照孔用洗液代替， 37℃,20min ▪ 洗板3次 ▪ 加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100μl/孔），
37℃,20min ▪ 洗板3次 ▪ 显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min;
（磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
Fc段 HRP-驴抗兔IgG(二抗)
14
间接ELISA
操作步骤
▪ 包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜 ▪ 封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200μl/孔），
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
荧光 黄色
测定波长
nm
492 450 449 425 642
400 500
405 420
360,450 420
21
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
其优点在于只要 变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗 体的方法。可用于 传染病的诊断。
10Biblioteka Baidu
夹心ＥＬＩＳＡ （检测抗原）
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制 备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
11
6
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
7
ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
8
直接ELISA
酶标一抗
9
间接法（测抗体）
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗 体以检测已与固相 抗原结合的受检抗 体，故称为间接法。
酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
▪ 原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗 体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被 酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
▪ 方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争 ELISA等
空白对照无显色
加酶标抗体：1:5000稀释 的HRP标记的驴抗兔IgG抗 血清， 37 ℃ 15min
加底物液显色
A,B两排同样操作，每孔加１００ul!
16
A,B排上样完全相同：复孔
A
B
123 4
5
6
78
9 10 11 12 无Ab,
仅稀释液
2-12号每孔１00uL稀释液，
１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２
底 物/DH2
邻苯二胺(OPD) 四甲替联苯胺(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，
混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！
每孔终体积100uL
17
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
病原微生物及其抗体检测如:肝炎病 毒,SARS等
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标记物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定
……
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
1
抗原-抗体反应的基本检测方法
凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。 补体参与的反应 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示 踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。
13
间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
鼠IgG(抗原)
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG
酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG
聚苯乙烯酶标板 水浴箱
移液器
枪头
免疫 兔抗小鼠IgG(一抗)
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS
2MH SO4终止反应 15
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔
37 ℃ 20min
抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 15min
EE
底物液100ul
→洗涤：3次，
1min/次
→ 洗涤：3次，
1min/次
→ 终止液50ul 终止液终止显色
18
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
科研服务
环境卫生
……
19
酶催化底物液显色
▪ DH2+ H2O2 E D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
▪ DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
20
酶 /E
辣根过氧化物酶 (HRP)
碱性磷酸酯酶 (AP) 葡萄糖氧化酶 (GOD) β-Ｄ－半乳糖苷 酶 (β-Gal)
竞争抑制法 （检测抗原）
待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
12
待检HBcAb 标准HBcAg
wash
wash
标准酶标 HBcAb
TMB
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；
2
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原 或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的 或可测定的。
3
免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
4
课程内容
▪ ELISA的原理 ▪ ELISA的分类 ▪ 间接ELISA的具体操作 ▪ ELISA在医学中的应用实例
5
酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)
37℃,20min ▪ 弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次 ▪ 加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（ 100μl/孔），以
200×起始，空白对照孔用洗液代替， 37℃,20min ▪ 洗板3次 ▪ 加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100μl/孔），
37℃,20min ▪ 洗板3次 ▪ 显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min;
（磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
Fc段 HRP-驴抗兔IgG(二抗)
14
间接ELISA
操作步骤
▪ 包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜 ▪ 封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200μl/孔），
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
荧光 黄色
测定波长
nm
492 450 449 425 642
400 500
405 420
360,450 420
21
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
其优点在于只要 变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗 体的方法。可用于 传染病的诊断。
10Biblioteka Baidu
夹心ＥＬＩＳＡ （检测抗原）
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制 备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
11
6
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
7
ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
8
直接ELISA
酶标一抗
9
间接法（测抗体）
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗 体以检测已与固相 抗原结合的受检抗 体，故称为间接法。
酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
▪ 原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗 体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被 酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
▪ 方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争 ELISA等
空白对照无显色
加酶标抗体：1:5000稀释 的HRP标记的驴抗兔IgG抗 血清， 37 ℃ 15min
加底物液显色
A,B两排同样操作，每孔加１００ul!
16
A,B排上样完全相同：复孔
A
B
123 4
5
6
78
9 10 11 12 无Ab,
仅稀释液
2-12号每孔１00uL稀释液，
１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２
底 物/DH2
邻苯二胺(OPD) 四甲替联苯胺(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，
混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！
每孔终体积100uL
17
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
病原微生物及其抗体检测如:肝炎病 毒,SARS等
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标记物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定
……