叶绿素荧光成像技术及其应用
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
叶绿素荧光成像技术及其应用
李川 易科泰生态技术公司EcoLab生态实验室
光合作用
• 光合作用是植物包括藻类及光合细菌吸收太阳能 、将CO2和水转化为有机物（化学能）并释放O2 的过程，其基本功能单位为叶绿体。
& /' ! "(- /& & *.% % *& - "(+"% (+.: : $! "& ' "% (#1*% "% ("% ' (! $% , 4 $"("' ($8*), $"6 ((
Ferimazova ，2013
• 镉、铜、锌、铬等重金属胁迫可以严重影响植物的光合能 力，FluorCam叶绿素荧光成像技术能够研究重金属对植物 叶片或其他器官宏观上的伤害，而FKM技术可以直观地研 究单个植物细胞里重金属积累对叶绿体的影响及不同细胞 之间的差异。（Küpper，2007）
忍冬叶片横切—— 栅栏组织和海绵组织
• PAM (Pulse Amplitude Modulated Fluorometer): Schreiber （1986）等发明了PAM脉冲调制技术。
典型荧光淬灭分析动力学曲线
• 引自Baker，2008
叶绿素荧光技术的研究领域
• • • • • • • • • 光合生理及机理研究 植物表型Phenotyping研究 植物生态学 作物抗逆 突变株筛选 产量预测 遗传育种 病虫害监测 水生/海洋生物学
• 柠檬被热水伤害后的叶绿素荧光成像（David， 2005）
A Pavlovič. 2011. Photosynthetic characterization of Australian pitcher plant Cephalotus follicularis. PHOTOSYNTHETICA, 49 (2): 253-258
易科泰生态技术公司Ecolab生态实验室 http://www.eco-tech.com.cn/ eco-lab@eco-tech.com.cn info@eco-lab.cn
• MCF多光谱荧光成像
• 作物病害早期无损检测
• 与叶绿素荧光成像技术结合共同研究
Chaerle，2006
Pérez-Bueno，2015
FKM多光谱荧光动态显微成像技术
• • • • FluorCam荧光成像技术 生物荧光显微成像技术 多光谱荧光测量技术 光谱分析技术
Berman-Frank，2001
! • P680 被激发后经由原初电子受体去镁叶绿素Pheo把电子传 "# $% !& % (; *(- 1*< & "(+"(' ! *& % : "! ' % (+= $)"- ' ! /& % (#1/' /% 2& ' 1$' .>, "6 !? @ ! $8.*' ./& % A (BC559 (#1/' /% 2% ' 34 "(55D ( 递给 QA ， QA 又把电子传递给另一质体醌 QB ， QB 接受 2 个 EF 9 ( ' 2! /% .& "( FD ( BG H I9 ( 4 /)$- , )"( +"( - 1)( *, ( - "& ' ! "( +"( #1/' /% 2% ' 34 "( 559 ( B1"9 ( 4 /)$-, )"( +"( 电子后从基质中吸取 2 个质子形成 PQH2 ，然后将电子传递 #1$/#12' .& "(D ( J ?9 ( >, .& /& "( ? 9 ( J K9 ( 4 /)$- , )"( +"( >, .& /& "( K(D ( BJ L M 9 ( #)*% ' />, .& /)"(D ( BJ 9 ( b6f Cytb6f ，电子再转移到质体蓝素 PC #)*% '给细胞色素 />, .& /& "(D (- 2' (@ :9 (- /4 复合体 #)"N "(+"(- 2' /- 1! /4 "(/4 #/% $(+"% (, & .' $% (@ ("' (: (D (BC59 (#1/' /% 2% '后 34 "(5(D ( G G BO9 (#)*% ' /- 2*& .& "(D (BPI I9 (4 /)$- , )"(+"(- 1)(*, (- "& ' ! "(+"(#1/' /% 2% ' 34 "(5(D (? A0 , )"(+"(- 1)(D (? Q9 ( I (4 /)$传递给 P700 ，经由原初电子受体 —— 叶绿素 a ，最终传 ,& "(递给铁氧还蛋白 4 /)$- , )"( +"( #12))/>, .& /& "(D ( RS 9 ( RK9 ( R? 9 ( #! /' $.& "% (% , ):, ! $"% ( "' ( :"! ! ",NADPH N (D ( R+9 (4 。 /)$-, )"( +"( Fd ，然后传递给 NADP+ 并形成
Ouyang，2010
Fan，2015
Screen mutants by NPQ parameters （通过荧光淬灭分析筛选变异植株）
• 在筛选对除草剂抗性强的玉米品种与基因型时， FluorCam叶绿素荧光成像可以直观并且定量地反映 其抗性及产生毒害部位的差异（Kopsell，2011）
光合色素的吸收光谱与叶绿素a荧光
叶绿素b及其它色素几乎不产生荧光
480 436
662
643
Govindjee 2004
光能的捕获、传递及叶绿素a荧光产生
热
荧光
Bacon Fra Baidu biblioteke 2003
• Butler于1978年提出PSII光化学反应、叶绿素荧光及热散失 三者的能量竞争模型，认为PSII反应中心将电子传递给原初 电子受体QA，导致Kautsky诱导效应中的叶绿素荧光降低（ “叶绿素荧光淬灭”），称为光化学淬灭（photochemical quenching），而由于热散失导致的叶绿素荧光淬灭则称为 非光化淬灭（nonphotochemical quenching of fluorescence） 。
Baker，2008，被引用次数1200
仪器结构
FluorCam系列荧光成像系统
FluorCam系列荧光成像系统的特点
• 国际知名度最高，发表SCI文章最多 • 仪器类型最为全面，成像面积从35×35cm（目前世界上最 大）到40倍显微镜，测量样品类型囊括了灌丛、整株植物 、叶片、花朵、果实、种子、细胞、微藻乃至叶绿体 • 灵敏度最高，时间分辨率达50帧/秒 • 仪器高度可定制，用户可以定制各种不同光质的光源和滤 光片，还可对GFP、EGFP、wtGFP、YFP、BFP或者其它波 段荧光蛋白和荧光素进行检测和成像，实现真正意义的多 光谱成像 • 软件功能强大，内置各种叶绿素荧光测量程序，包括独有 的OJIP曲线测定和QA再氧化过程分析，也允许用户根据自 己需要编辑测量程序，还具备自动重复测量功能
Xin Li, Dandan Niu, Molecular Cloning and Characterization of Violaxanthin De-Epoxidase (CsVDE) in Cucumber, PLOS ONE, 2013
水分对沙漠中苔藓的光合特性的影响
加水0.5 h后
G. Li, Effects of nitrogen on photosynthetic characteristics of leaves from two different stay-green corn (Zea mays L.) arieties at the grain-filling stage, 2012, Can. J. Plant Sci.
拟南芥表面成像—— 细胞内的叶绿体分布
玉米表皮细胞荧光成像
表皮细胞成像—— 气孔与叶绿体
叶绿素荧光的光谱分析
LED智能培养与生理监测
Duarte，2014
Santos，2014
植物生理生态监测技术方案
• EMS-ET植物生理生态监测系统 • 植物生理生态监测系统：PTM48+BTC-100+叶绿素荧光监测 • 植物生长生理生态在线监测：PM-11z＋大型FytoScope智能 LED生长箱，或PM-11z+SoilTron小型蒸渗仪 • 光合仪＋叶绿素荧光技术，如iFL、FluorCam叶绿素荧光成 像与光合测量复合系统等，或光合仪＋FluorPen等组合方 案 • OTC-Auto+PTM48/PM11z+BTC-100等组成植物生理生态监测 系统 • FluorPen、PlantPen、PolyPen RP400、LaiPen等
智能手持式荧光仪—FP100&AP100
叶绿素荧光仪的局限性
• 仅能通过光纤测量一个点的总值
• 只能获得数据和动力学曲线图
• 一般只能测量叶片
• 在进行光合相关突变体筛选时工作量极大
叶绿素荧光成像技术的发展
• Ladislav Nedbal（2000）等于上 世纪90年代末期发明了与PAM 技术相结合的叶绿素荧光成像 技术，研制成功了第一台 FluorCam调制式荧光成像仪。 从此正式开启了叶绿素荧光研 究的二维时代。
加利福尼亚大学保护生物学研究中心（Vargas，2008） 原位研究监测土壤表面与剖面CO2浓度、根系及土壤过 程的时空动态变化
• BTC-100微根窗根系 观测系统、 • 3层土壤剖面CO2、 水分、温度观测系 统 • Li8100和ACE土壤呼 吸监测系统
上图：细根长度（上图空心蓝点）、菌根长度（上图实心红点）及 土壤呼吸动态变化； 下图：土壤温度与土壤体积含水量的动态变化（DOY为Day of year）
• 烟草感染真菌后的各种叶绿素荧光成像，从而对 病害和植株抗性进行定量分析（Tung，2013）
AR Nejad, J Harbinson, U Meeteren. 2006. Dynamics of spatial heterogeneity of stomatal closure in Tradescantia virginiana altered by growth at high relative air humidity. Journal of Experimental Botany, 57(14): 3669-3678
: "! ! "+/N .& "6 !
叶绿素荧光的发展历程
• Kautsky effect: Kautsky and Hirsch (1931) 首次用肉眼发现 叶绿素荧光现象并发表论文“CO2同化新实验”：经过暗 适应的植物材料照光后，叶绿素荧光先迅速上升到一个最 大值，然后逐渐下降，最后达到一个稳定值。这种现象后 被称作“Kautsky effect”即Kautsky诱导效应。
土壤呼吸研究监测技术方案
• 便携式： – Soilbox 343 – SRS1000/2000 – Soilbox-FMS/FGA • 实验室： – SoilLab – EGA60 • 自动监测系统： – ACE与ACE-Net – OTC-Auto – SCG-N • 扩展配置：＋BTC-100，＋土壤水分，＋PTM48
李川 易科泰生态技术公司EcoLab生态实验室
光合作用
• 光合作用是植物包括藻类及光合细菌吸收太阳能 、将CO2和水转化为有机物（化学能）并释放O2 的过程，其基本功能单位为叶绿体。
& /' ! "(- /& & *.% % *& - "(+"% (+.: : $! "& ' "% (#1*% "% ("% ' (! $% , 4 $"("' ($8*), $"6 ((
Ferimazova ，2013
• 镉、铜、锌、铬等重金属胁迫可以严重影响植物的光合能 力，FluorCam叶绿素荧光成像技术能够研究重金属对植物 叶片或其他器官宏观上的伤害，而FKM技术可以直观地研 究单个植物细胞里重金属积累对叶绿体的影响及不同细胞 之间的差异。（Küpper，2007）
忍冬叶片横切—— 栅栏组织和海绵组织
• PAM (Pulse Amplitude Modulated Fluorometer): Schreiber （1986）等发明了PAM脉冲调制技术。
典型荧光淬灭分析动力学曲线
• 引自Baker，2008
叶绿素荧光技术的研究领域
• • • • • • • • • 光合生理及机理研究 植物表型Phenotyping研究 植物生态学 作物抗逆 突变株筛选 产量预测 遗传育种 病虫害监测 水生/海洋生物学
• 柠檬被热水伤害后的叶绿素荧光成像（David， 2005）
A Pavlovič. 2011. Photosynthetic characterization of Australian pitcher plant Cephalotus follicularis. PHOTOSYNTHETICA, 49 (2): 253-258
易科泰生态技术公司Ecolab生态实验室 http://www.eco-tech.com.cn/ eco-lab@eco-tech.com.cn info@eco-lab.cn
• MCF多光谱荧光成像
• 作物病害早期无损检测
• 与叶绿素荧光成像技术结合共同研究
Chaerle，2006
Pérez-Bueno，2015
FKM多光谱荧光动态显微成像技术
• • • • FluorCam荧光成像技术 生物荧光显微成像技术 多光谱荧光测量技术 光谱分析技术
Berman-Frank，2001
! • P680 被激发后经由原初电子受体去镁叶绿素Pheo把电子传 "# $% !& % (; *(- 1*< & "(+"(' ! *& % : "! ' % (+= $)"- ' ! /& % (#1/' /% 2& ' 1$' .>, "6 !? @ ! $8.*' ./& % A (BC559 (#1/' /% 2% ' 34 "(55D ( 递给 QA ， QA 又把电子传递给另一质体醌 QB ， QB 接受 2 个 EF 9 ( ' 2! /% .& "( FD ( BG H I9 ( 4 /)$- , )"( +"( - 1)( *, ( - "& ' ! "( +"( #1/' /% 2% ' 34 "( 559 ( B1"9 ( 4 /)$-, )"( +"( 电子后从基质中吸取 2 个质子形成 PQH2 ，然后将电子传递 #1$/#12' .& "(D ( J ?9 ( >, .& /& "( ? 9 ( J K9 ( 4 /)$- , )"( +"( >, .& /& "( K(D ( BJ L M 9 ( #)*% ' />, .& /)"(D ( BJ 9 ( b6f Cytb6f ，电子再转移到质体蓝素 PC #)*% '给细胞色素 />, .& /& "(D (- 2' (@ :9 (- /4 复合体 #)"N "(+"(- 2' /- 1! /4 "(/4 #/% $(+"% (, & .' $% (@ ("' (: (D (BC59 (#1/' /% 2% '后 34 "(5(D ( G G BO9 (#)*% ' /- 2*& .& "(D (BPI I9 (4 /)$- , )"(+"(- 1)(*, (- "& ' ! "(+"(#1/' /% 2% ' 34 "(5(D (? A0 , )"(+"(- 1)(D (? Q9 ( I (4 /)$传递给 P700 ，经由原初电子受体 —— 叶绿素 a ，最终传 ,& "(递给铁氧还蛋白 4 /)$- , )"( +"( #12))/>, .& /& "(D ( RS 9 ( RK9 ( R? 9 ( #! /' $.& "% (% , ):, ! $"% ( "' ( :"! ! ",NADPH N (D ( R+9 (4 。 /)$-, )"( +"( Fd ，然后传递给 NADP+ 并形成
Ouyang，2010
Fan，2015
Screen mutants by NPQ parameters （通过荧光淬灭分析筛选变异植株）
• 在筛选对除草剂抗性强的玉米品种与基因型时， FluorCam叶绿素荧光成像可以直观并且定量地反映 其抗性及产生毒害部位的差异（Kopsell，2011）
光合色素的吸收光谱与叶绿素a荧光
叶绿素b及其它色素几乎不产生荧光
480 436
662
643
Govindjee 2004
光能的捕获、传递及叶绿素a荧光产生
热
荧光
Bacon Fra Baidu biblioteke 2003
• Butler于1978年提出PSII光化学反应、叶绿素荧光及热散失 三者的能量竞争模型，认为PSII反应中心将电子传递给原初 电子受体QA，导致Kautsky诱导效应中的叶绿素荧光降低（ “叶绿素荧光淬灭”），称为光化学淬灭（photochemical quenching），而由于热散失导致的叶绿素荧光淬灭则称为 非光化淬灭（nonphotochemical quenching of fluorescence） 。
Baker，2008，被引用次数1200
仪器结构
FluorCam系列荧光成像系统
FluorCam系列荧光成像系统的特点
• 国际知名度最高，发表SCI文章最多 • 仪器类型最为全面，成像面积从35×35cm（目前世界上最 大）到40倍显微镜，测量样品类型囊括了灌丛、整株植物 、叶片、花朵、果实、种子、细胞、微藻乃至叶绿体 • 灵敏度最高，时间分辨率达50帧/秒 • 仪器高度可定制，用户可以定制各种不同光质的光源和滤 光片，还可对GFP、EGFP、wtGFP、YFP、BFP或者其它波 段荧光蛋白和荧光素进行检测和成像，实现真正意义的多 光谱成像 • 软件功能强大，内置各种叶绿素荧光测量程序，包括独有 的OJIP曲线测定和QA再氧化过程分析，也允许用户根据自 己需要编辑测量程序，还具备自动重复测量功能
Xin Li, Dandan Niu, Molecular Cloning and Characterization of Violaxanthin De-Epoxidase (CsVDE) in Cucumber, PLOS ONE, 2013
水分对沙漠中苔藓的光合特性的影响
加水0.5 h后
G. Li, Effects of nitrogen on photosynthetic characteristics of leaves from two different stay-green corn (Zea mays L.) arieties at the grain-filling stage, 2012, Can. J. Plant Sci.
拟南芥表面成像—— 细胞内的叶绿体分布
玉米表皮细胞荧光成像
表皮细胞成像—— 气孔与叶绿体
叶绿素荧光的光谱分析
LED智能培养与生理监测
Duarte，2014
Santos，2014
植物生理生态监测技术方案
• EMS-ET植物生理生态监测系统 • 植物生理生态监测系统：PTM48+BTC-100+叶绿素荧光监测 • 植物生长生理生态在线监测：PM-11z＋大型FytoScope智能 LED生长箱，或PM-11z+SoilTron小型蒸渗仪 • 光合仪＋叶绿素荧光技术，如iFL、FluorCam叶绿素荧光成 像与光合测量复合系统等，或光合仪＋FluorPen等组合方 案 • OTC-Auto+PTM48/PM11z+BTC-100等组成植物生理生态监测 系统 • FluorPen、PlantPen、PolyPen RP400、LaiPen等
智能手持式荧光仪—FP100&AP100
叶绿素荧光仪的局限性
• 仅能通过光纤测量一个点的总值
• 只能获得数据和动力学曲线图
• 一般只能测量叶片
• 在进行光合相关突变体筛选时工作量极大
叶绿素荧光成像技术的发展
• Ladislav Nedbal（2000）等于上 世纪90年代末期发明了与PAM 技术相结合的叶绿素荧光成像 技术，研制成功了第一台 FluorCam调制式荧光成像仪。 从此正式开启了叶绿素荧光研 究的二维时代。
加利福尼亚大学保护生物学研究中心（Vargas，2008） 原位研究监测土壤表面与剖面CO2浓度、根系及土壤过 程的时空动态变化
• BTC-100微根窗根系 观测系统、 • 3层土壤剖面CO2、 水分、温度观测系 统 • Li8100和ACE土壤呼 吸监测系统
上图：细根长度（上图空心蓝点）、菌根长度（上图实心红点）及 土壤呼吸动态变化； 下图：土壤温度与土壤体积含水量的动态变化（DOY为Day of year）
• 烟草感染真菌后的各种叶绿素荧光成像，从而对 病害和植株抗性进行定量分析（Tung，2013）
AR Nejad, J Harbinson, U Meeteren. 2006. Dynamics of spatial heterogeneity of stomatal closure in Tradescantia virginiana altered by growth at high relative air humidity. Journal of Experimental Botany, 57(14): 3669-3678
: "! ! "+/N .& "6 !
叶绿素荧光的发展历程
• Kautsky effect: Kautsky and Hirsch (1931) 首次用肉眼发现 叶绿素荧光现象并发表论文“CO2同化新实验”：经过暗 适应的植物材料照光后，叶绿素荧光先迅速上升到一个最 大值，然后逐渐下降，最后达到一个稳定值。这种现象后 被称作“Kautsky effect”即Kautsky诱导效应。
土壤呼吸研究监测技术方案
• 便携式： – Soilbox 343 – SRS1000/2000 – Soilbox-FMS/FGA • 实验室： – SoilLab – EGA60 • 自动监测系统： – ACE与ACE-Net – OTC-Auto – SCG-N • 扩展配置：＋BTC-100，＋土壤水分，＋PTM48