RNA的剪接机制

RNA的剪接机制
酶母tRNA的剪接
RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。

酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。

这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。

不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。

所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变，即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。

在前体中仅反密码臂受到影响，tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。

酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。

此剪切过程可分为两个阶段。

第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。

这一步由一种内切核酸酶所催化。

第二
ATP P 步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。

在无AT 时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。

这两个半分子具有独特
ATP P 的末端:其5'端有OH基，而3'有一个2'，3'-环磷酸基。

当加入AT 时，即发生第二步反应:两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。

2'，3'-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。

在人的HeL
HeLa a 细胞中，RNA连接酶能将带有2'，3'-环磷酸基的RNA和另一带有
5'-OH基的RNA直接连接起来。

酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。

这表示剪接反应没有种属特异性。

爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。

自身剪接反应
以前一直认为只有蛋白质有酶活性。

这个概念在生物化学界已根
RNA A 深蒂固。

然而近期发现RNA也可有酶活性。

这种有酶活性的RN
有人称之为ribozyme。

一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似(见前文)，被转录在同一个初级转录本中。

此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5'侧，较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。

在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的(约400bp)内含子。

如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用:内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。

这个反应仅需要加入一种一价阳离子，一种二价阳离子，和一种鸟嘌呤核苷酸(G)。

其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。

这表示此反应并不需要能量供应。

此外，此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。

这个G要连接到内含子的5'端上(通过通常的磷酸二酯键)。

当线性的内含子成为环状时，其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处，从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内)排除出去。

这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。

外显子A的3'-OH基可直接和外显
子B的5'端相连接。

亦即一个磷酸酯可以直接被转移到另一个上去，不需要经过中间步骤(如水解作用之类)，因此磷酸酯键的能量被保存着。

这解释了为什么此反应不需要水解ATP或GTP来供应能量。

同时，两次磷酸酯转移反应似乎是紧密相连的，因为始终没有找到过游离的外显子(A或B)。

而线性内含子的环化则可以被看作是第三个磷酸酯转移反应。

在体外系统中进行剪接时，并不需要蛋白质的存在。

RNA有能力自行剪接，故称为自身催化作用(auto catalysis)。

T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用。

从而
Nobel l 改变了生物催化剂的传统概念。

为此他们共同获得了1989年Nobe 化学奖。

1978年Altman从纯化的RNA酶P中分离出一种多肽和一种RNA(M1RNA)。

最初的实验结果表明，蛋白质和M1RNA单独都没有酶活性，但二者混合在一起又可恢复活性。

其它生物材料的实验结果表明M1RNA是RNA酶P活性所必须的。

1983年Altoman证
tRNA A 明，在较高浓度的Mg2+存在下，单独的M1RNA就可以催化tRN 前体的成熟，而单独的蛋白质则没有这种能力。

这样，RNA即可看作是个酶。

事实上，M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。

原来认为蛋白质赋予酶的活性，RNA只起某种辅助作用(例
如帮助蛋白质与其底物结合)，但现在发现这两种功能已经倒转。

Cec
Cech h 给具有催化活性的RNA定名为ribozyme。

很长时间以来，人们就试图自己设计和生产酶分子，但因蛋白质分子结构上的复杂性，迄今为止，尚无成功的例子。

近年来随着ribozyme的发现，人工酶(新概念下的酶，它的构件分子是核苷酸)的设计又产生了新的希望。

澳大利亚的科学家就设计了九个ribozyme分子，它们都具备内切酶的活性，且切割位点有高度特异性。

同时，ribozyme的活性随pH、温度、及阳离子浓度的变化而变化，显示出典型的酶特性。

由于ribozyme的作用位点高度特异，故可以用来切割特定的基因转录产物(RNA)。

有人将这种切割作用叫做抗基因活性。

因为切割的结果破坏了RNA，也就是抑制了基因的表达。

这种特性为我们进行基因和病毒的治疗提供了一个可行的途径。

某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子。

一些常见的真菌，如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的线粒体内含子都能进行自身剪接，像四膜虫中进行的磷酸酯转移反应一样。

能够编码蛋白质的内含子
某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构，这些内含子有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。

编码细胞色素b的box基因在仅剪去内含子1时，会产生RNA成熟
酶的mRNA。

当内含子2亦被剪去时，才是细胞色素b的编码顺序的开端。

线粒体中的box基因是编码细胞色素b(cytb)的。

box基因中的外显子1有417bp，编码cytb的N端139个密码子。

内含子1有765bp，不编码。

外显子2非常短，仅有5个密码子。

其后是一个很长的内含子2。

内含子2的特点是其开头840bp是一个开放读框(ORF)，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。

当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通读过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质(其中144个是cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码，称为RNA成熟酶(maturase)。

RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。

这样，这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。

去除内含子2后，外显子1和2即与外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。

细胞核中的剪接连接点
剪接连接点(splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。

在内含子左侧的连接点称为供体(donor)，在内含子右侧的称为受体(acceptor)。

在细胞核的结构基因(即编码多肽的基因)中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GT．..AG的共同顺序。

较详细的共同顺序如下，供体位点受体位点：
...Py10CAG↓↓...外显子
外显子...AG
...AG↓↓GTAAGT...内含子...Py10CAG
箭头表示切断的键。

这些还是较短的共同顺序，存在于几乎所有的真核生物中。

从上述共同顺序可见供体和受体位点之间并无互补现象，所以不可能想像这两个位点会通过碱基配对而结合一起，以便于内含子的切除。

正确的剪接并依赖于天然前体RNA分子的完整性。

一个外源基因如果存在于病毒顺序中，仍能很好地被剪接。

另外，前体RNA亦能在不同的组织，或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。

这都表示剪接作用是很保守的。

一个真正基因中一个外显子可以和另一个基因的外显子连接起来。

例如，将SV40(猴病毒40)的早期转录单位的第一外显子和小鼠β珠蛋白的第三外显子相连，这样形成的杂交内含子仍能正确地被剪接。

即SV40的内含子的供体位点(1I)可以剪接到小鼠β珠蛋白的内含子的受体位点(r2)上。

套索的产生
HeLa细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体，这表示剪接作用并不与转录作用相关连。

RNA的修饰也和剪接无关，例如珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾链，也没有加帽，仍能正常地被剪接。

剪接过程可分为两个阶段，与上文所述自身剪接不需能量不同，核内剪接需要用ATP。

在第一阶段中，内含子左端(供体位点)处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子-外显子。

左外显子此时为-线性分子，但右内含子-外显子则不然:内含子左端(5'端)以5'-2'键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列(共同序列)中的A相连接，于是形成一个"套索"(lariat)"。

在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去;同时分离的右外显子即与左外显子相连接。

套索然后被"脱支(debranch)"而形成一线性内含子。

在这种剪接机构中，有三个很短的共同顺序，即供体和受体位点处于一个和套索分支处的一个序列。

用酵母做的实验证明:分支处的共同顺序如果发生突变或缺失将使剪接不能进行。

这个共同顺序常称为TACTAAC盒。

它和左侧的供体位点共同顺序互补，但研究证明两者并不发生碱基配对。

在高等真核生物中此分支靶顺序的保守性较小。

snRNAs的作用
真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多
小RNA，它们约有100到300个碱基，每个细
胞中可含有105-106个这种RNA分子。

它们是
由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像
mRNA一样可被加帽。

在细胞核中的小RNA称
为snRNA，而在细胞浆中的称为scRNA。

但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。

某些snRNPs和剪接
作用有密切关系。

有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。

snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。

人U1snRNP中除RNA外还8个蛋白质分子。

人U1snRNA的可能二级结构如图。

其5'端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。

在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。

在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。

U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用;而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。

事实上，除去U1sn RNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。

U5snRNA A能识别右侧(受体位点)共同顺序;而U2snRNA，有可能U5snRN
U2snRNA A
U2snRNP P的抗体可以和U2snRN 则具有与分支位点互补的顺序。

抗U2snRN
及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。

U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。

另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。

一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。

最小的是U6，有约100核苷酸长。

最大的是U3，也不过215核苷酸长。

它们和蛋白质结合成snRNPs。

系统性红斑狼疮(SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。

核内不均一RNA
编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。

但是核浆中的RNA 却并不像mRNA 。

核浆RNA 要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。

由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。

已经证明mRNA 确实是从hnRNA 生成的。

细胞浆内的mRNA 平均只有1800-2000个碱基。

而哺乳动物的hnRNA 平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA 大4-5倍。

如果以5倍计算，由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA 仅占hnRNA 量的5%，则相当于有25%的hnRNA 可转变为mRNA 。

这意味着有3/4的hnRNA 即在核内降解。

hnRNA 被切除内含子后即成为mRNA ，并进入细胞浆内。

但在切除内含子之前，hnRNA 可先加帽和加poly(A)尾链。

有一种称为poly(A)
聚合酶的酶可以用ATP 为底物，以加上poly(A)尾链，这是hnRN hnRNA
A 转变为成熟的mRNA 所必须的。

在哺乳动物细胞中，仅约30%的
hnRN hnRNA A 被多聚腺苷酸化，而mRN mRNA
A 中却约70%是有poly(A)尾链的。

可能多聚腺苷酸化是hnRNA 分子要被加工的信号。

hnRNA 的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。

因为RNA 聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA 尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上poly(A)。