生物质谱分析

美国科学家约翰· 芬恩1917年出生 于美国纽约市，1940年获耶鲁大 学化学博士学位，1967年到1987 年间任该大学教授，1987年起被 聘为该大学名誉教授，自1994年 起任弗吉尼亚联邦大学教授。他 因为“发明了对生物大分子进行 确认和结构分析的方法”和“发 明了对生物大分子的质谱分析法” 而获得今年诺贝尔化学奖1／4的 奖金。
质谱技术中的离子源
(1) 电子轰击电离源 (Electron Impact Ionization,
简称 EI):样品需经过汽化进入电离区，用约70e V能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使 分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离 ，为硬电离方法。1980年以 前的主要离子化方式， 只能用于有机小分子 (400Da以下)的电离。
具有速度 的带电离子进入质谱分析器的 电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种 离子按质荷比的不同实现分离。
质谱仪的分类
二、质谱仪的基本结构
1. 真空系统 2. 进样系统 3. 离子源 4. 质量分析器 5. 检测与记录
计算机控制与数 据处理
质谱仪的构造和功能
1. 真空系统
• 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在 高真空状态下工作，一般应在10-5～10-6Pa。 (1) 真空度差，过多的氧气将损耗或烧毁离子源 的灯丝； (2)高本低气压将干扰质谱图; (3)电离空气压过高，会发生离子-分子反应，改 变碎片谱图； (4)离子源内的高气压将干扰电子束的调节； (5) 电离气或离子源内的高气压，可能引起高达 数千伏的离子加速电压放电。
通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装臵 将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热 处理。
对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气 体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可 直接引入到离子源。
这种进样方式不必使样品充满整个储存器，
因此，可适用样品量较小和蒸汽压较低的物质。
直接进样法扩大了质谱法的应用范围。
APCI 主要部件是一个双层套管组成的电喷雾的喷嘴， 喷嘴内层是液相色谱流出物，外层是雾化气，通常为大流 量的N2，其作用是使喷出的液体分散成微滴。在喷嘴的下 游有一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空 气中某些中性分子电离，产生H3O+, N2+, O2+等离子，这些 离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子 化。
(3)毛细管进样 气相色谱-质谱联用仪
从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引 入质谱仪的离子化室。
液相色谱-质谱联用仪 采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样 品离子进入质谱分析仪。
3. 离子源
质谱仪中产生离子的装臵称为离子源，其功能 是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。 不同的分子离子化所需要的能量不同，因此， 应选择不同的离解方式： 硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。 软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易 破裂或易电离的样品。
2002年诺贝尔化学奖获得者
瑞士科学家库尔特· 维特里希 1938年生于瑞士阿尔贝格， 1964年获瑞士巴塞尔大学无 机化学博士学位，从1980年 起担任瑞士苏黎世联邦高等 理工学校的分子生物物理学 教授，还任美国加利福尼亚 州拉霍亚市斯克里普斯研究 所客座教授。他因“发明了 利用核磁共振技术测定溶液 中生物大分子三维结构的方 法”而获得2002年诺贝尔化 学奖一半的奖金。 日本科学家田中耕一(Koichi Tanaka)1959年出生于日本富山 县首府富山市，1983年获日本 东北大学学士学位，现任职于 京都市岛津制作所，为该公司 研发工程师，分析测量事业部 生命科学商务中心、生命科学 研究所主任。他对化学的贡献 类似于约翰· 芬恩，因此也得到 了1／4的奖金。
质谱技术中的离子源
(6)电喷雾电离 (Electrospray Ionization，简称ESI) :是一种使用强静电场的电离技术。它主要应用 于液相色谱 - 质谱联用仪或毛细管电泳 - 质谱联 用仪，既作为色谱和质谱之间的接口装臵，同 时又是电离装臵。
电喷雾电离是在“离子蒸发”的原理基础上 发展起来的一种离子化方法。待测分子溶解在溶 剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口 高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中的 挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随微滴 半径的减少而增加，到达某一临界点时，样品将 以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，即实现 了样品的离子化，由于没有直接的外界能量作用 于分子，因此，对分子结构破坏较少，是一种典 型的软电离方式。
电喷雾电离优缺点
缺点 ①耐盐能力低； ②对某些化合物特别敏感，污染难清洗； ③样品需先气化； ④带多电荷，在分析混合物时，产生混乱； ⑤定量时需内校准。
电喷雾与大气压化学电离的比较
电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放 电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。 样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷雾源允 许流量相对较小,一般为0.2-1 ml／min. 断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合 物就足以使其分解. 适用性：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和 生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于 分析极性较小的化合物。 多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子
生物分析技术
第5讲 生物质谱分析
2011年10月
主要内容
第一节 概述
第二节
第三节
质谱仪
生物质谱的应用
第一节
概述
质谱分析法 (Mass Spectroscope,MS) 是将 化合物形成离子或碎片离子，按质荷比 (m/z)的 不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析 的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图 ）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定 性和定量分析，生物大分子的结构分析，同位 素的测定及固体表面的结构和组成分析。 生物质谱就是用于生物分子分析的质谱技 术。由于生物分子大多数以其高相对分子质量 区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小 分子，因而，生物质谱要求测定上万甚至几十 万的分子质量。
电喷雾电离优缺点
优点 ① 测定分子质量高； ② 灵敏度极高（10-15mol）； ③ 软电离，可观察生物分子非共价反应； ④ 易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液； ⑤ 没有基质干扰； ⑥ 适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析 ； ⑦ 带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子 ，通过计算平均值给出更精确的质量数； ⑧ 特别适于测多肽的修饰； ⑨ 样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。
早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子 的研究，因为要将质谱应用于生物大分子需要将 其制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解 成离子。如何使蛋白分子经受住离子化过程而又 不丧失其结构形态是个难题。 20世纪70年代，解 吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子 ，而后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质使得 具有极性、热不稳定的蛋白分子可经受住电离过 程。但这些方法仅限于10kD以下蛋白分子的研究 。80年代电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电 离 (MAILDI) 技术的发展则使得质谱方法成功应 用于高分子量蛋白分子的研究。
快原子轰击技术缺点：
试样涂在金属板上，溶剂也被电离，使质谱图复 杂化。
质谱技术中的离子源
(5)大气压化学电离源 (Atmospheric Pressure Che mical Ionization ，简称 APCI): 主要用于液相 色谱 - 质谱联用仪，主要用来分析中等极性、 弱极性化合物。 APCI 主要产生单电荷离子， 分析化合物的相对分子质量一般小于1000.
第二节
质谱仪
一、质谱仪的工作原理
二、质谱仪的基本结构 1. 真空系统 2. 进样系统 3. 离子源 4. 质量分析器 5. 检测与记录
一、质谱仪的工作原理
样品导 入系统
离子源
质量过滤/分析器
检测器
+ + +
+++ + + + + +++ + ++ + + + + + + + + + + + + + ++ +++ +++
(1)间歇式进样系统
可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品 进样，通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ拆卸式的试样管将少量固体或液体 试样引入试样储存器中。 由于进样系统的低压强及储存器的加热装臵， 使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源 的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以 分子流的形式渗透进高真空的离子源。
(2)直接探针进样
电子轰击电离的优缺点
优点 缺点 ①灵敏度高； ①质量范围小； ②有达10万个化合物的数 ②有可能汽化前发生解 据库可快速检索； 离； ③可根据碎片方式鉴定未 ③碎片过多有时看不到 知物； 分子离子。 ④从碎片离子判定结构。
质谱技术中的离子源
(2)化学电离源 (Chemical Ionization, 简称 CI):高 能电子束与小分子反应气（如甲烷、丙烷等） 作用，使其电离生成初级离子，这些初级离 子在与试样分子反应得到试样离子，核心是 质子转移。 (3)场电离 (Field Ionization, 简称 FI):在相距很近 的电极间施加高电压，产生强电场，依靠这 个强电场将附近的试样分子中的电子拉出来， 使之形成离子。
电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子， 因此，在较小的 m/z 范围内可以检测到大分子质 量的分子。电喷雾质谱目前可测定分子质量在10 0.000Da 以下的蛋白质，最高达 150.000Da 。适宜 相对分子质量大、稳定性差的化合物，如极性强 的大分子有机化合物，蛋白质、肽、糖等。除分 析大分子外，电喷雾质谱也可分析小分子，对于 分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物质的 分子质量。
质谱技术中的离子源
(4) 快原子轰击源(Fast Atom Bombardment，简 称FAB):20世纪80年代发展起来的新离子化方 法，是让稀有气体（氙气或氩气）电离，通 过电场加速，获得较高动能成为快原子，然 后轰击试样分子， 通过能量的转移， 使试样分子电离。
快原子轰击技术优点： ①分子离子和准分子离子峰强； ②碎片离子峰丰富； ③灵敏度高，适用于热不稳定、极性强的分子， 如肽类、蛋白质、多糖、金属有机物等。
质谱技术中的离子源
(7)基质辅助激光解吸离子化 (Matrix Assisted Lase r Desorption，简称MALDI):是近20年发展起来的 离子化技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷 酸等生物大分子的离子化。通常用飞行时间检测 器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸/电离 飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的 测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分 子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多 态性的分析等。
样品板
EI源 FAB源 MALDI源 ESI源
Quadruopole Ion trap Time-of-flight
电子倍增器 闪烁计数器
LC或GC
化合物分子在高真空条件下，受高速电子流 “轰击”或强电场其他作用，失去电子生成离子 或发生化学键断裂成为碎片离子，离子经加速器 进入磁场，其动能与加速电压及电荷遵循： zU=(1/2)m2 m/z=2U/ 2
质谱仪的发展历史
1906年 在 J.JThomson在实验中发现带电荷离子 电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关 并于1912年制造出第一台质谱仪 飞行时间质量分析器 四极杆质量分析器 质谱仪首次用于多肽测序 离子共振质谱 电喷雾离子源 傅里叶变换离子回旋共振分析器 基质辅助激光解吸电离质谱
1946年 1953年 1959年 1965年 1968年 1974年 1987年
• 一般质谱仪由机械真空泵(低真空泵)，扩散泵或 分子泵(高真空泵)组成真空机组，使离子源和分 析器部分的达到真空。 • 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到 达接收器，真空度不够则灵敏度低。
2. 进样系统
要求： 高效重复的将样品引入到离子源中并且不能 造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决 定于样品的物理性质。 方式： (1)间歇式进样系统 (2)直接探针进样 (3)毛细管进样（从HPLC、GC及CE）
影响电喷雾电离的因素：
①样品的pKa和溶液的pH 样品离子取决于样品在喷雾溶液中是否形 成离子，正离子检测中，溶液pH应较低，负离 子检测，溶液pH应较高。
②溶剂的性质 用于电喷雾电离的溶剂应能使样品在溶液 中形成离子，既有较低的溶剂化能力以利于离 子蒸发，具有较低的黏度和表面张力以利于雾 化以及具有较低热容量以利于溶剂化。