蜡状芽孢杆菌的分离培养与鉴定
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７０ ８０ ９０ ９８
１０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ １０１２
２０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ １０１２
３０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ ０
１０１５
４０
１０１３ １０１３ １０１３ １０１２ ０
５０
１０１３ １０１３ １０１２ １０１２ ０
２．２．４ 耐酸碱性。本菌在 ｐＨ 值 ３．０ ～９．０ 的 ＭＳＳ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
本研究从牛奶中所分离的蜡状芽孢杆菌 ＣＯ４－ １（自命名）菌株，在进行试验的过程中发现 除具有普通芽孢杆菌的特点外，还具有营养要求 低、生长速度快，耐高温，耐酸碱，合成蛋白质能力 强，与酵母菌一起培养时，能产生一种特殊的酒香 气味等特点。在进行灌服仔猪试验时，发现对预防 肠道疾病具有一定的效果。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 ＭＳＰ 培养基、ＭＳＳ 培养基、普通 琼脂培养基、普通肉汤培养基、具有鉴别意义的生 化培养基和 Ｒｏｇｏｓａ 等培养基均自配。麦康凯琼 脂、ＳＳ 琼脂、伊红美兰琼脂从市场购入。酵母菌由 本室保存，牛奶从本校奶牛场采取。 １．２ 试验方法 １．２．１ 分离培养。将牛奶煮沸 １０ ｍｉｎ，室温（２０ ～ ３０ ℃）放置 ２ ～３ ｄ，取少许接种到普通琼脂平板 培养基和 ＭＳＰ 培养基上培养，３７ ℃，培养 ２４ ｈ， 挑选大菌落在 ＭＳＰ 培养基上进行再一次分离，放 入 ４５ ℃温箱，培养 ２４ ｈ，作为所分 离的菌株 ＣＯ４－ １。再将 ＣＯ４－ １ 菌接种到普通肉汤和 ＭＳＳ 培 养基中作为菌种之用。另取含 ９．５ ｍＬ ＭＳＳ 培养基 ３ 支分别加入 ０．５ ｍＬ 菌液，３７ ℃温箱，培养 ２４ ｈ， 再测定细菌总数和世代时间。 １．２．２ 培养特性的测定（马西艺等，２００３）。１）培养
含量 ３１２０ ３１００ ４２００
产物名称 乙酸 异丁酸 琥珀酸
含量 ８００ １２００ １４０
２．５ 动物试验
（下转第 １９ 页）
２００５ 年第 １５ 期
中国饲料
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水解，能产生具有阿片活性的肽类，在体内消化时 也可产生阿片活性物质 （Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ 等，１９８１）。 食物源阿片活性肽不仅能够对胃肠道消化液的分 泌起调节作用（Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ 等，２００３），而且会影响 动物体的内分泌调节（Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ 等，１９８１）。这 与本试验结果一致。利用甲醛保护反刍动物日粮 中的小麦蛋白质，不仅过瘤胃的小麦谷蛋白增加， 这些小麦谷蛋白在胃蛋白酶的作用下可能会释放 出阿片活性肽，从而使十二指肠食糜中阿片样物 质的总活性增强，进而改善湖羊的复胃消化代谢 和内分泌机能。由于小麦中的蛋白质在消化酶作 用下，会产生多种阿片活性肽 （Ｆｕｋｕｄｏｍｅ 等， １９９７；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ 和 Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，１９９３、１９９２），而且 反刍动物消化道中也会产生内源性阿片活性肽， 因此我们仅测定了皱胃食糜中阿片样物质总的生 物活性。关于小麦中的蛋白质在湖羊消化道中形 成阿片活性肽的种类与数量，以及形成的阿片活 性肽对反刍动物的消化和内分泌的调节机理有待 进一步的研究。目前，随着农业科技的不断发展， 小麦的产量不断提高，国内有一定份额的小麦已 成为或必将成为反刍家畜饲料。由于传统的饲料 加工方法，使这一部分小麦的饲料报酬过低，从而 影响了相关的种植业和养殖业的积极性，本研究 的结果对解决上述问题提供了新思路。
２００５ 年第 １５ 期
中国饲料
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蜡状芽孢杆菌的分离培养与鉴定
湖南农业大学动物科学技术学院 何月英 曾德年 胡仕凤 宁玲忠 晏美清
［摘要］ 从牛奶中分离到一株蜡状芽孢杆菌 ＣＯ４－ １，经生长特性培养、生化试验、灌服动物试验，证明该菌株具有
营养要求低、生长速度快、合成蛋白质能力强、耐高温、耐酸碱等特点，菌体及其产物对动物无任何不良反应，对肠道
还可保持这种气味。
２．３ 生化试验 ＣＯ４－ １ 菌能分解葡萄糖、半乳
糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖、果糖，
并产酸，不能分解乳糖。甲基红试验、硝酸盐还原
试验、淀粉水解酶试验、接触酶试验 ＶＰ 均为阳
性，吲哚试验为阴性（见表 ２）。
表 ２ ＣＯ４－ １ 菌生化试验测定结果
培养基及试验 葡萄糖 麦芽糖 阿拉伯糖 木糖 甘露醇 蔗糖 果糖 乳糖
（基金项目：中德农业科技合作项目资助，项 目编号：１９９９－ ２０００，Ｎｏ １７）
参考文献
［１］ Ｂｒａｎｔｌ Ｖ，Ｔｅｓｃｈｅｍａｃｈｅｒ Ｈ，Ｈｅｎｓｃｈｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅ－ ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｓｅｉｎ ［Ｊ］．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９７９，３６０ （９）：１２１１ ～ １２１６． ［２］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｊｉｎｓｍａａ Ｙ，Ｍａｔｓｕｋａｗａ Ｔ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｒ ｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｇｌｕｔｅｎ ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｌａｓｔａｓｅ ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９７，４１２（３）：４７５ ～４７９． ［３］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｇｌｕｔｅｎ ｅｘｏｒｐｈｉｎ Ｃ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅ－ ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔｅｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９３，３１６（１）：１７ ～１９． ［４］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔｅｎ： ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９２，２９６（１）：１０７ ～１１１． ［５］ Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ Ｖ，Ｈｅｎｒｉｃｈｓ Ｉ，Ｈｏｌｌａｎｄ Ａ，Ｋｌｉｅｒ Ｍ，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ Ｅ Ｆ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｄｏｇｓ［Ｊ］．Ｄｉａ－ ｂｅｔｅｓ，１９８１，３０（４）：３６２ ～３６４． ［６］ Ｓｈａｒｍａ Ｓ Ｋ，Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ Ｍ，ＫＩｅｅ Ｗ Ａ．Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９７５，７２ （２）：５９０ ～ ５９４． ［７］ Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ Ａ，Ｃｌａｕｓｔｒｅ Ｊ，Ｃａｉｌｌｏｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｌｋ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｂｅｔａ－ ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｕｃｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｒａｔ ｊｅｊｕｎｕｍ ［Ｊ］．Ｊ Ｎｕｔｒ，２００３，１３３（１１）： ３４９９ ～３５０３．
培养基中的均能生长，其中以 ７．０ ～９．０ 生长最 佳，菌数达 １０１５ 个／ｍＬ。
２．２．５ 与酵母菌共同培养。将 ＣＯ４－ １ 菌和酵母菌
共同在 ＭＳＰ 培养基上培养，两者均能生长良好，
以 ＣＯ４－ １ 菌生长较旺，并产生一种很浓的酒香气
味。这种平板培养物放 ５ ～１０ ℃冰箱 １ ～２ 个月，
结果 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
培养基及试验 半乳糖 硝酸盐 甲基红 淀粉酶 接触酶 ＶＰ 吲哚
结果 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
２．４ 代谢产物测定结果 ＣＯ４－ １ 菌能分解葡萄
糖和淀粉，产生一些蛋白质、酸类和醇类物质（见
表 ３）。 表 ３ ＣＯ４－ １ 菌代谢产物测定结果 ｍｇ／Ｌ
产物名称 蛋白质 乙醇 乳酸
病原菌具有一定的抑制作用。
［关键词］ 蜡状芽孢杆菌；分离培养；鉴定
［中图分类号］ Ｓ８１６．７
［文献标识源自文库］ Ａ
［文章编号］ １００４－ ３３１４（２００５）１５－ ００１５－ ０３
［Ａｂｓ ｔｒａｃｔ］ Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＣＯ４－ １ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｂｉｏ－
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ，ｗｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｌｏｗ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｑｕｉｃｋ ｇｒｏｗｔｈ，ｂｅｔｔｅｒ ａ－
ｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｅａｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ａｎｄ ｓａｆｅ ｔｏ ａｎｉｍａｌ．ＣＯ４ － １ ｃｏｕｌｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ
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中国饲料
２００５ 年第 １５ 期
肌醇、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖、果糖、半乳糖 培养基中进行糖发酵试验。接种到 ＭＳＰ 斜面、葡 萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐和淀粉培养基进 行生化特性测定，接种后，放 ３７ ℃温箱，培养 ４８ｈ，观察试验结果。 １．２．４ 代谢产物的测定（杜冰等，２００１）。将 ＣＯ４－ １ 菌液体培养物菌数约为 １０１５ 个／ｍＬ，３０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ，取上清液，用高压液相色谱仪测定 代谢产物中的乳酸、丁酸、丙酮、琥珀酸、异丁酸乙 醇，用定氮仪测定蛋白质含量。 １．２．５ 动物试验。１）动物毒性试验：将 ＣＯ４－ １ 菌 液（含菌 数 １０１５ 个／ｍＬ），灌服小 白鼠 ６ 只，每头 ０．５ ｍＬ，另罐服 １０ 头仔猪，每只 ５ ｍＬ，同时设对 照组。２）仔猪肠道疾病预防试验（秦玉昌，２００４；杜 冰等，２００１）。用 ＣＯ４－ １ 菌液灌服 ３ ～５ 日龄仔猪， ５４ 头，共 ６ 胎，每胎留 ２ ～３ 头不服菌液作为对 照，观察 ７ ｄ，并记录结果。 ２ 结果与分析 ２．１ 分离培养和纯培养 ＣＯ４－ １ 菌在有氧或无 氧的条件下均能生长，无氧比有氧生长好。１）菌落 形态：在普通琼脂平板培养基上，３７ ℃，培养 ２４ｈ， 可形成圆形或近似圆形，质地软，无色素，稍有光 泽的白色菌落，（似蜡烛样颜色）直径 ５ ～７ ｍｍ。 在 ＭＳＰ 培养基上生长更旺盛，菌落直径达 ８ ～１０ ｍｍ，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌 落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。２）个体形 态：将分离培养和纯培养的培养物制片，作革兰氏 染色，可见单个散在或形成 ３ ～５ 链状排列，有偏 端芽孢，菌体两端钝圆，为革兰氏阳性较大的短杆 状细菌。３）液体培养性状的结果：ＣＯ４－ １ 菌在液 体培养基中呈均匀分化混浊生长，培养 ２４ ｈ 之 后，形成小块状沉淀，沉于管底，振摇不散。４）菌数 与世代时间：ＣＯ４－ １ 菌液进行计数，含菌数为 １０１５ 个／ｍＬ，平均世代时间为 ２０ ｍｉｎ。 ２．２ 培养特性 ２．２．１ 培养基适应性。ＣＯ４－ １ 菌株适应于普通琼 脂、普通肉汤 ＭＳＰ、ＭＳＳ、Ｒｏｇｏｓａ 和血清琼脂培养 基上生长，在 ＳＳ 琼脂、麦康凯琼脂和伊红美兰琼 脂培养基不生长。 ２．２．２ 温度适应性。ＣＯ４－ １ 菌株在 ２５ ～５０ ℃，培 养 ２４ ｈ，均能生长良好，５５ ℃以上不生长，１５ ～ ２０℃生长缓慢。
基的适应性测定。将 ＣＯ４－ １ 菌分别接种到 ＭＳＰ 固体培养基、普通琼脂培养基、Ｒｏｇｏｓａ 琼脂培养 基（用于分离乳酸杆菌的）和血清琼脂、麦康凯琼 脂、ＳＳ 琼脂、伊红美兰琼脂培养基上，每种培养基 接种 ２ 皿，放 ３７ ℃，培养 ２４ ｈ，一皿作有氧培养， 另一皿作厌氧培养。２）温度适应性测定。取少许 ＣＯ４－ １ 菌液接种到 ＭＳＰ 固体培养基上，分别放入 １５、２０、２５、３０、３７、４０、４５、５０、６０ ℃温箱，进行有氧 培养，２４ ｈ 后，观察菌落生长情况。３）高温耐受性 测定。将 ＣＯ４－ １ 菌液 ０．５ ｍＬ，接种到 ９．５ ｍＬ ＭＳＳ 液体培养基中，接种 ３２ 支，分别经 ５０、６０、７０、８０、 ９０、９８ ℃ 湿 热 处 理 １０、２０、３０、４０、５０ ｍｉｎ， 再 放 ３７℃温箱，培养 ２４ ｈ，余下两支不经处理，直接放 ３７℃温箱培养作为对照，用细菌比浊法计算每支 液体培养物的细菌数。４）耐酸碱性测定。取 ｐＨ 值 为 ３．０、５．０、７．０、８．０、９．０ 的 ＭＳＳ 培养基各 １ 支，每 支 ９．５ ｍＬ，加入 ＣＯ４－ １ 菌液 ０．５ ｍＬ，放 ３７ ℃温 箱，培养 ２４ ｈ，用细菌比浊法计数。５）与酵母菌共 同培养。用 ＣＯ４－ １ 菌株在 ＭＳＰ 培养基上划线，再 取少许酵母菌在同一培养基上划线，放 ３０ ℃温 箱，培养 ２４ ｈ，观察菌落生长情况。再将 ＣＯ４－ １ 菌 和酵母菌分别接种到 ＭＳＰ 培养基上作为对照。 １．２．３ 生化试验（杜冰等，２００１；王世若，１９９０）。取 ＣＯ４－ １ 菌液，分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、
２．２．３ 高温耐受性。ＣＯ４－ １ 菌株在 ６０ ～９０ ℃ 处
理 １０ ～１５ ｍｉｎ 均可生长，在 ９８ ℃处理 １０ ～２０
ｍｉｎ 也可生长，处理 ３０ ～５０ ｍｉｎ 不能生长（见表
１）。
表 １ 湿热处理 ＣＯ４－ １ 菌的生长情况 ＣＦＵ／ｍＬ
处理时间（ｍｉｎ） ６０
温度处理（℃） 对照组 ３７ ℃
１０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ １０１２
２０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ １０１２
３０
１０１５ １０１４ １０１４ １０１３ ０
１０１５
４０
１０１３ １０１３ １０１３ １０１２ ０
５０
１０１３ １０１３ １０１２ １０１２ ０
２．２．４ 耐酸碱性。本菌在 ｐＨ 值 ３．０ ～９．０ 的 ＭＳＳ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
本研究从牛奶中所分离的蜡状芽孢杆菌 ＣＯ４－ １（自命名）菌株，在进行试验的过程中发现 除具有普通芽孢杆菌的特点外，还具有营养要求 低、生长速度快，耐高温，耐酸碱，合成蛋白质能力 强，与酵母菌一起培养时，能产生一种特殊的酒香 气味等特点。在进行灌服仔猪试验时，发现对预防 肠道疾病具有一定的效果。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 ＭＳＰ 培养基、ＭＳＳ 培养基、普通 琼脂培养基、普通肉汤培养基、具有鉴别意义的生 化培养基和 Ｒｏｇｏｓａ 等培养基均自配。麦康凯琼 脂、ＳＳ 琼脂、伊红美兰琼脂从市场购入。酵母菌由 本室保存，牛奶从本校奶牛场采取。 １．２ 试验方法 １．２．１ 分离培养。将牛奶煮沸 １０ ｍｉｎ，室温（２０ ～ ３０ ℃）放置 ２ ～３ ｄ，取少许接种到普通琼脂平板 培养基和 ＭＳＰ 培养基上培养，３７ ℃，培养 ２４ ｈ， 挑选大菌落在 ＭＳＰ 培养基上进行再一次分离，放 入 ４５ ℃温箱，培养 ２４ ｈ，作为所分 离的菌株 ＣＯ４－ １。再将 ＣＯ４－ １ 菌接种到普通肉汤和 ＭＳＳ 培 养基中作为菌种之用。另取含 ９．５ ｍＬ ＭＳＳ 培养基 ３ 支分别加入 ０．５ ｍＬ 菌液，３７ ℃温箱，培养 ２４ ｈ， 再测定细菌总数和世代时间。 １．２．２ 培养特性的测定（马西艺等，２００３）。１）培养
含量 ３１２０ ３１００ ４２００
产物名称 乙酸 异丁酸 琥珀酸
含量 ８００ １２００ １４０
２．５ 动物试验
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水解，能产生具有阿片活性的肽类，在体内消化时 也可产生阿片活性物质 （Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ 等，１９８１）。 食物源阿片活性肽不仅能够对胃肠道消化液的分 泌起调节作用（Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ 等，２００３），而且会影响 动物体的内分泌调节（Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ 等，１９８１）。这 与本试验结果一致。利用甲醛保护反刍动物日粮 中的小麦蛋白质，不仅过瘤胃的小麦谷蛋白增加， 这些小麦谷蛋白在胃蛋白酶的作用下可能会释放 出阿片活性肽，从而使十二指肠食糜中阿片样物 质的总活性增强，进而改善湖羊的复胃消化代谢 和内分泌机能。由于小麦中的蛋白质在消化酶作 用下，会产生多种阿片活性肽 （Ｆｕｋｕｄｏｍｅ 等， １９９７；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ 和 Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，１９９３、１９９２），而且 反刍动物消化道中也会产生内源性阿片活性肽， 因此我们仅测定了皱胃食糜中阿片样物质总的生 物活性。关于小麦中的蛋白质在湖羊消化道中形 成阿片活性肽的种类与数量，以及形成的阿片活 性肽对反刍动物的消化和内分泌的调节机理有待 进一步的研究。目前，随着农业科技的不断发展， 小麦的产量不断提高，国内有一定份额的小麦已 成为或必将成为反刍家畜饲料。由于传统的饲料 加工方法，使这一部分小麦的饲料报酬过低，从而 影响了相关的种植业和养殖业的积极性，本研究 的结果对解决上述问题提供了新思路。
２００５ 年第 １５ 期
中国饲料
１５
蜡状芽孢杆菌的分离培养与鉴定
湖南农业大学动物科学技术学院 何月英 曾德年 胡仕凤 宁玲忠 晏美清
［摘要］ 从牛奶中分离到一株蜡状芽孢杆菌 ＣＯ４－ １，经生长特性培养、生化试验、灌服动物试验，证明该菌株具有
营养要求低、生长速度快、合成蛋白质能力强、耐高温、耐酸碱等特点，菌体及其产物对动物无任何不良反应，对肠道
还可保持这种气味。
２．３ 生化试验 ＣＯ４－ １ 菌能分解葡萄糖、半乳
糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖、果糖，
并产酸，不能分解乳糖。甲基红试验、硝酸盐还原
试验、淀粉水解酶试验、接触酶试验 ＶＰ 均为阳
性，吲哚试验为阴性（见表 ２）。
表 ２ ＣＯ４－ １ 菌生化试验测定结果
培养基及试验 葡萄糖 麦芽糖 阿拉伯糖 木糖 甘露醇 蔗糖 果糖 乳糖
（基金项目：中德农业科技合作项目资助，项 目编号：１９９９－ ２０００，Ｎｏ １７）
参考文献
［１］ Ｂｒａｎｔｌ Ｖ，Ｔｅｓｃｈｅｍａｃｈｅｒ Ｈ，Ｈｅｎｓｃｈｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅ－ ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｓｅｉｎ ［Ｊ］．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９７９，３６０ （９）：１２１１ ～ １２１６． ［２］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｊｉｎｓｍａａ Ｙ，Ｍａｔｓｕｋａｗａ Ｔ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｒ ｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｇｌｕｔｅｎ ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｌａｓｔａｓｅ ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９７，４１２（３）：４７５ ～４７９． ［３］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｇｌｕｔｅｎ ｅｘｏｒｐｈｉｎ Ｃ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅ－ ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔｅｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９３，３１６（１）：１７ ～１９． ［４］ Ｆｕｋｕｄｏｍｅ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．Ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔｅｎ： ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９２，２９６（１）：１０７ ～１１１． ［５］ Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ Ｖ，Ｈｅｎｒｉｃｈｓ Ｉ，Ｈｏｌｌａｎｄ Ａ，Ｋｌｉｅｒ Ｍ，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ Ｅ Ｆ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｄｏｇｓ［Ｊ］．Ｄｉａ－ ｂｅｔｅｓ，１９８１，３０（４）：３６２ ～３６４． ［６］ Ｓｈａｒｍａ Ｓ Ｋ，Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ Ｍ，ＫＩｅｅ Ｗ Ａ．Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９７５，７２ （２）：５９０ ～ ５９４． ［７］ Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ Ａ，Ｃｌａｕｓｔｒｅ Ｊ，Ｃａｉｌｌｏｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｌｋ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｂｅｔａ－ ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｕｃｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｒａｔ ｊｅｊｕｎｕｍ ［Ｊ］．Ｊ Ｎｕｔｒ，２００３，１３３（１１）： ３４９９ ～３５０３．
培养基中的均能生长，其中以 ７．０ ～９．０ 生长最 佳，菌数达 １０１５ 个／ｍＬ。
２．２．５ 与酵母菌共同培养。将 ＣＯ４－ １ 菌和酵母菌
共同在 ＭＳＰ 培养基上培养，两者均能生长良好，
以 ＣＯ４－ １ 菌生长较旺，并产生一种很浓的酒香气
味。这种平板培养物放 ５ ～１０ ℃冰箱 １ ～２ 个月，
结果 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
培养基及试验 半乳糖 硝酸盐 甲基红 淀粉酶 接触酶 ＶＰ 吲哚
结果 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
２．４ 代谢产物测定结果 ＣＯ４－ １ 菌能分解葡萄
糖和淀粉，产生一些蛋白质、酸类和醇类物质（见
表 ３）。 表 ３ ＣＯ４－ １ 菌代谢产物测定结果 ｍｇ／Ｌ
产物名称 蛋白质 乙醇 乳酸
病原菌具有一定的抑制作用。
［关键词］ 蜡状芽孢杆菌；分离培养；鉴定
［中图分类号］ Ｓ８１６．７
［文献标识源自文库］ Ａ
［文章编号］ １００４－ ３３１４（２００５）１５－ ００１５－ ０３
［Ａｂｓ ｔｒａｃｔ］ Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＣＯ４－ １ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｂｉｏ－
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔ，ｗｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｌｏｗ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｑｕｉｃｋ ｇｒｏｗｔｈ，ｂｅｔｔｅｒ ａ－
ｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｅａｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ａｎｄ ｓａｆｅ ｔｏ ａｎｉｍａｌ．ＣＯ４ － １ ｃｏｕｌｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ
１６
中国饲料
２００５ 年第 １５ 期
肌醇、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖、果糖、半乳糖 培养基中进行糖发酵试验。接种到 ＭＳＰ 斜面、葡 萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐和淀粉培养基进 行生化特性测定，接种后，放 ３７ ℃温箱，培养 ４８ｈ，观察试验结果。 １．２．４ 代谢产物的测定（杜冰等，２００１）。将 ＣＯ４－ １ 菌液体培养物菌数约为 １０１５ 个／ｍＬ，３０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ，取上清液，用高压液相色谱仪测定 代谢产物中的乳酸、丁酸、丙酮、琥珀酸、异丁酸乙 醇，用定氮仪测定蛋白质含量。 １．２．５ 动物试验。１）动物毒性试验：将 ＣＯ４－ １ 菌 液（含菌 数 １０１５ 个／ｍＬ），灌服小 白鼠 ６ 只，每头 ０．５ ｍＬ，另罐服 １０ 头仔猪，每只 ５ ｍＬ，同时设对 照组。２）仔猪肠道疾病预防试验（秦玉昌，２００４；杜 冰等，２００１）。用 ＣＯ４－ １ 菌液灌服 ３ ～５ 日龄仔猪， ５４ 头，共 ６ 胎，每胎留 ２ ～３ 头不服菌液作为对 照，观察 ７ ｄ，并记录结果。 ２ 结果与分析 ２．１ 分离培养和纯培养 ＣＯ４－ １ 菌在有氧或无 氧的条件下均能生长，无氧比有氧生长好。１）菌落 形态：在普通琼脂平板培养基上，３７ ℃，培养 ２４ｈ， 可形成圆形或近似圆形，质地软，无色素，稍有光 泽的白色菌落，（似蜡烛样颜色）直径 ５ ～７ ｍｍ。 在 ＭＳＰ 培养基上生长更旺盛，菌落直径达 ８ ～１０ ｍｍ，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌 落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。２）个体形 态：将分离培养和纯培养的培养物制片，作革兰氏 染色，可见单个散在或形成 ３ ～５ 链状排列，有偏 端芽孢，菌体两端钝圆，为革兰氏阳性较大的短杆 状细菌。３）液体培养性状的结果：ＣＯ４－ １ 菌在液 体培养基中呈均匀分化混浊生长，培养 ２４ ｈ 之 后，形成小块状沉淀，沉于管底，振摇不散。４）菌数 与世代时间：ＣＯ４－ １ 菌液进行计数，含菌数为 １０１５ 个／ｍＬ，平均世代时间为 ２０ ｍｉｎ。 ２．２ 培养特性 ２．２．１ 培养基适应性。ＣＯ４－ １ 菌株适应于普通琼 脂、普通肉汤 ＭＳＰ、ＭＳＳ、Ｒｏｇｏｓａ 和血清琼脂培养 基上生长，在 ＳＳ 琼脂、麦康凯琼脂和伊红美兰琼 脂培养基不生长。 ２．２．２ 温度适应性。ＣＯ４－ １ 菌株在 ２５ ～５０ ℃，培 养 ２４ ｈ，均能生长良好，５５ ℃以上不生长，１５ ～ ２０℃生长缓慢。
基的适应性测定。将 ＣＯ４－ １ 菌分别接种到 ＭＳＰ 固体培养基、普通琼脂培养基、Ｒｏｇｏｓａ 琼脂培养 基（用于分离乳酸杆菌的）和血清琼脂、麦康凯琼 脂、ＳＳ 琼脂、伊红美兰琼脂培养基上，每种培养基 接种 ２ 皿，放 ３７ ℃，培养 ２４ ｈ，一皿作有氧培养， 另一皿作厌氧培养。２）温度适应性测定。取少许 ＣＯ４－ １ 菌液接种到 ＭＳＰ 固体培养基上，分别放入 １５、２０、２５、３０、３７、４０、４５、５０、６０ ℃温箱，进行有氧 培养，２４ ｈ 后，观察菌落生长情况。３）高温耐受性 测定。将 ＣＯ４－ １ 菌液 ０．５ ｍＬ，接种到 ９．５ ｍＬ ＭＳＳ 液体培养基中，接种 ３２ 支，分别经 ５０、６０、７０、８０、 ９０、９８ ℃ 湿 热 处 理 １０、２０、３０、４０、５０ ｍｉｎ， 再 放 ３７℃温箱，培养 ２４ ｈ，余下两支不经处理，直接放 ３７℃温箱培养作为对照，用细菌比浊法计算每支 液体培养物的细菌数。４）耐酸碱性测定。取 ｐＨ 值 为 ３．０、５．０、７．０、８．０、９．０ 的 ＭＳＳ 培养基各 １ 支，每 支 ９．５ ｍＬ，加入 ＣＯ４－ １ 菌液 ０．５ ｍＬ，放 ３７ ℃温 箱，培养 ２４ ｈ，用细菌比浊法计数。５）与酵母菌共 同培养。用 ＣＯ４－ １ 菌株在 ＭＳＰ 培养基上划线，再 取少许酵母菌在同一培养基上划线，放 ３０ ℃温 箱，培养 ２４ ｈ，观察菌落生长情况。再将 ＣＯ４－ １ 菌 和酵母菌分别接种到 ＭＳＰ 培养基上作为对照。 １．２．３ 生化试验（杜冰等，２００１；王世若，１９９０）。取 ＣＯ４－ １ 菌液，分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、
２．２．３ 高温耐受性。ＣＯ４－ １ 菌株在 ６０ ～９０ ℃ 处
理 １０ ～１５ ｍｉｎ 均可生长，在 ９８ ℃处理 １０ ～２０
ｍｉｎ 也可生长，处理 ３０ ～５０ ｍｉｎ 不能生长（见表
１）。
表 １ 湿热处理 ＣＯ４－ １ 菌的生长情况 ＣＦＵ／ｍＬ
处理时间（ｍｉｎ） ６０
温度处理（℃） 对照组 ３７ ℃