细胞工程学专业复习资料

绪论

一．细胞工程（Cell Engineering）：（定义）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。

分类（包括）:（填空）植物细胞工程和动物细胞工程

植物细胞工程：（定义）以植物细胞组织为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物新个体，或获得有用物质的过程。

动物细胞工程：（定义）是根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门技术。

二．（填空）细胞学说的提出：施旺，施莱登（1838年）

三．1902年，H aberlandt提出了细胞全能性学说。

第一章基本技术

一．湿热灭菌：103-137kPa(121-126°C),15-30min.

二．干热灭菌：利用烘箱加热到位60-180°C

三．培养基基本成分：无机盐（大量元素，微量元素），有机成分（激素，植物生长调节剂），水

常用有机成分：糖类（蔗糖），维生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸

激素：生长素（根），细胞分裂素（芽），赤霉素（细胞伸长）

四．基本培养基种类：MS,B5,N6,White(P26)

（1）高盐平衡培养基：MS培养基、LS培养基、BL培养基、BM培养基和ER培养基。特点：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性；营养丰富；微量元素种类全，浓度高。

（2）高硝态氮培养基：B5培养基，N6培养基及SH培养基等。特点：硝酸钾的含量高，氨态氮的含量低，含有较高的盐酸硫胺素。

（3）中盐培养基：H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基和Blaydes培养基。特点：大量元素无机盐约为MS的一般，微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS多。

（4）低盐培养基：White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基及HB培养基等。特点：无机盐含量低，有机成分含量相对也很低。

五．培养基配制：1000ml母液需100ml大量元素(10*),10ml微量元素(100*)……

1 培养基母液配制

无机盐按大量元素、微量元素和铁盐3部分分别配制。大量元素一般配制成（10－20）×母液，微量元素和铁盐则配制成（100－200）×母液。有机成分最好单独配制。配好的母液需贮存于

2－4℃冰箱中。

植物激素使用的浓度很低，因此，一般分别配制成0.1-1mg/L浓度的溶液。

2 培养基制备

制备培养基时是根据实际需要配制，首先按大量元素、微量元素、铁盐及有机成分的顺序，依次吸取各母液的需要量，加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入适当体积的蒸馏水，并称取相应量的蔗糖放入其中溶解，调节pH值，加入琼脂，加热使其完全融化，最后用蒸馏水定容并分装。

六．外植体：指用于离体培养的活的植物组织，器官等材料。

三种来源：1.生长在自然环境下的植物 2.在温室控制环境条件下生长的植物 3.无菌环境下培养的植物（最优）。

第二章细胞全能性与形态发生

一．细胞全能性：（定义）一个细胞所具有的产生完整个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。

二．细胞脱分化（cell dedifferentiation ）：（定义）培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。

分化细胞脱分化分生细胞再分化分化细胞

静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。

蛋白体的出现和细胞质密度增加被认为是细胞开始脱分化的标志。

三．细胞分化（Differentiation）：（定义）是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

四．极性（polarity）：（定义）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。

五．激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素。

先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。

六．（简答）植物的离体器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

不定根、不定芽：是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根或芽。

器官发生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部长出根进而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上产生不定芽进而形成完整植株。

3）在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。

七．愈伤组织：实质上是一团无序生长的细胞，这些细胞大多处于随机分裂的状态。

（器官、组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位）

八．体细胞胚或胚状体（定义）：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。

界定：

1）体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚。

2）体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚。

3）体细胞经过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。

研究体细胞胚的模式植物：胡萝卜。

九．体细胞胚的形成途径：（简答）

1.体细胞胚从外植体上直接发生：诱导阶段;胚胎发育阶段

2.间接发生：A.经过愈伤组织的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织的形成→诱导愈伤组织

胚性化→体细胞胚的形成 2，4-D(浓度高)

2，4-D(浓度低) 2，4-D(浓度更低)

B.经过悬浮细胞的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织的形成→诱导愈伤组织胚性化→悬浮培养的胚性细胞团→体细胞胚的形成。

十．植株再生的两种方式：器官发生，体细胞胚发生。

第三章体细胞遗传变异

一．体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系。

体细胞无性系变异：由体细胞无性系表现出来的变异。

从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。二．离体培养中的遗传与变异特点：遗传稳定性；变异的普遍性；变异的局限性；嵌合性三．非遗传变异

四．体细胞无性系变异的诱导与选择：（愈伤组织>再生植株（变异））

诱变起始材料的选择原则：目标性状的可行性；试验植物的细胞培养技术水平；适当的细胞类型

七．设计实验：培养抗纹枯病的水稻——

突变体的选择：（1）直接选择

（2）间接选择：

外遗传变异

生理适应性变异

基因表达（生长素自养型变）

第四章植物组织细胞培养

一．植物脱毒：利用植物组织培养技术脱出植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。二．脱毒基本原理：病毒在植物体内的分布具有不均匀性。

三．脱毒苗制备流程：索取材料的病毒检测外植体的选择及预处理茎尖分生组织培养再生植株脱毒效果检测脱毒苗的保存与繁殖

四．（填空、简答）培养物的增殖方式：1.腋芽增殖2.不定芽增殖3.体细胞胚增殖

4.愈伤组织增殖

五．花药培养（定义）：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。

从培养类型来讲，花药培养仍然属于器官培养的范畴。

花粉培养（定义）：又叫小孢子培养，是从花药中分离除花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。花粉培养属于细胞培养的范畴。

花粉培养取材时期：四分体小孢子时期；

花药培养取材时期：单核晚期，双核早期。

六．花药培养的基本程序：外植体选择—外植体预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养。

七．花粉分离方法：

（1）机械分离法：将花药置于盛有少量液体培养基或与培养基等渗的蔗糖溶液的培养皿中，用平头的玻璃棒或注射器内管轻轻挤压花药，使其散出花粉。

（2）花药漂浮培养自然释放法：将经过一定时间低温处理的花药，接种于液体培养基中，培养数天后，花药开裂，释放出花粉粒。

（3）磁拌法:将花药接种于含有液体培养基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。

八．根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括：胚培养，胚乳培养，胚珠培养，子房培养。

九．幼胚培养的关键技术：

取材时期：多为球形胚至鱼雷形胚阶段。

十．幼胚离体培养的常见的生长发育方式：胚性发育，早熟萌发，愈伤组织。

十一．悬浮培养：是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

应用：1.愈伤组织诱导：要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。

诱导愈伤组织选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

诱导愈伤组织选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。

2.悬浮系的建立与继代培养：

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件（简答）：

A．悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞以下，在实际培养

中很少会有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮体系。

B．均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮体系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白色或淡黄色。

C．细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。

3.悬浮细胞的生长动态：P89图5-6 （填空——五个时期）

延滞期，对数生长期，直线生长期，减慢期，静止期。（在减慢期进行继代培养）

4.悬浮培养细胞的同步化：

细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

（填空）同步化的方法：分选法；饥饿法；抑制剂法；低温法P91

十二。单细胞培养方法：1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、双层滤纸植板培养5、悬浮培养(简答)P86

十三。培养条件下的植物细胞次生产物积累特性：1.生长偶联型：产物合成与细胞生长成正比。如长春花碱、烟碱的合成 2.中间型：产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。如蒽醌类物质合成的植物细胞 3.非生长偶联型：产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。

第五章原生质体培养及杂交

一．原生质体（protoplast）：除去细胞壁的裸露细胞。

二．原生质体的纯化方法：（填空）

1、沉降法：甘露醇作渗透压调节剂，低速离心，原生质体沉降于管底。

2、漂浮法：蔗糖作渗透压调节剂，离心，原生质体漂浮于溶液表面。

3、梯度离心法：利用比重不同的溶液，离心，原生质体处在两液相的界面之间。

三．原生质体培养方法：（P118）1。液体浅层培养2。固体平板培养3。固液双层培养4.琼脂糖珠培养（摇床震荡）5.悬滴培养法：在培养皿盖上滴悬浮液，皿底加入培养液，皿盖翻过来盖于皿底上，封口培养。6.微滴培养法：悬浮液滴于皿底，封口培养。7.饲养层培养法：又称看护培养。先制备饲养层，再在其上培养有活力的原生质体。

四．原生质体活力测定方法：（P114）

1.形态识别法

2.荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生质体产生绿色荧光。

3.酚藏花红染色法：有活力的原生质体不能被染色。4、荧光增白剂染色法：有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。5、伊凡蓝染色法：有活力的原生质体不能被染色。

※五．植物体细胞杂交：又称为原生质体融合，是指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。

植物细胞杂交的类型：1）体细胞杂交2）体细胞-配子杂交3）配子间细胞杂交4）微细胞杂交原生质体融合的种类（完整程度）：1）对称融合 2）非对称融合

※六．原生质体的融合方法之一:PEG诱导融合法

1）特点：优点是成本低；融合子产生的异核率高；不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG

对细胞有毒害。

2）作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，可与带正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形

成H键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；PEG还

鞥增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

七．原生质体的融合方法之二：电融合的基本过程

细胞膜的接触：原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，使原生质体紧密接触排列成串。

膜的击穿：给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合

在一起。

优点：1）不存在对细胞的毒害问题2）融合效率高3）融合技术操作简便

八．（填空）原生质体的融合产物：异核体（核未融合）、同核体（同一亲本融合 AA）、未发

生融合的双亲原生质体。

九．杂种细胞的选择系统与体细胞杂种植株的鉴定（P131-132）（实验设计题）

例：材料月季（红）玫瑰（白）培养月季式玫瑰……

分离……原生质体：纯化、活力测定融合方法杂种选择杂种植株鉴定膜的融合---细胞质融合（发生膜融合后的数小时）---核融合（可能发生在细胞间期，也

可能发生在第一次同步分裂过程中）。

第六章人工种子及种质贮藏

一．人工种子（artificial seeds）：任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能

力的繁殖体。

根据包被的程度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的繁殖体、人工种皮包被的繁殖体、

水凝胶包埋再包被的繁殖体。

二．繁殖体的种类及其培养技术：体细胞胚、微型变态器官、微芽。

三．人工种子由以下三部分组成：繁殖体，人工胚乳，人工种皮。

四．包埋介质的要求：1、要能对繁殖体起保护作用，要对繁殖体没有毒害。2、要求具有一定

的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。3、能够提供类似于胚乳的营养

物质以供繁殖体发芽的需要。4、应含有适当的杀菌剂。

五．理想的人工种皮：1具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失；

2具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要；

3有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作；

4无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。

第七章动物细胞培养

一．离体培养的动物细胞可分为：贴壁依赖型，非贴壁依赖型，兼性贴壁细胞。

二．原代培养：将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10

代左右，这样的细胞称为原代细胞。

三．传代培养：从原代培养的细胞继续转结培养称为传代培养。

四．细胞系：由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群称作细胞系

五．培养细胞的保存1、冻存2、复苏。（慢冻快融）。

第八章干细胞

干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

第九章克隆技术与转基因动物

一．细胞核移植定义：利用显微操作技术将一种动物的细胞核转入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得的杂种称为核质杂种。根据移植对象的不同分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。

二．克隆技术的应用：1、检验动物细胞的全能性；2、制备转基因克隆动物，进行生物药物生产3、培育优良畜种，扩大良种种群；4、开展异种动物克隆，拯救濒危动物；5、与干细胞技术结合，开展治疗性克隆；6、利用核移植技术，研究生物学的基本问题。

三．转基因动物：指在基因组内稳定的整合以实验方法导入外源基因，并且外源基因可以稳定遗传给后代的遗传工程动物。

四．转基因动物的制备过程：1、目的基因的分离与克隆；2、表达载体的构建；3、受体细胞的获得；4、基因导入；5、受体动物的选择及转基因胚胎的移植；6、转基因整合表达的检测；7、转基因动物的性能观测及转基因表达产物的分离与纯化；8、转基因动物的遗传性能研究以及性能选育；9、组建转基因动物新类群。