蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究

２％% 起始 ｐＨ 值为 ４．５ 和 ６．５ 时有 ２ 个产酶高峰% 并对其进行酶学性质的研究& 该酶最适温度为６５ "% 最适 ｐＨ 值为
７．５% 该酶在 ５０ #以下保温 ３０ ｍｉｎ 酶活仍较高% 在 ７０ $以上酶活全部丧失& 在 ｐＨ 值 ７．０￣９．０ 时比较稳定% 而在 ｐＨ
值 ５．０ 以下时酶活下降很快& 金属离子 Ｐｂ２＋% 鳌合剂 ＥＤＴＡ 能抑制蛋白酶的活性% 而 Ｆｅ２＋ 能激活蛋白酶活性&
在 此 反 应 条 件 下 定 义 $ 每 １ ｍｉｎ 生 成 １ ｕｇ 酪 氨 酸所需酶量定义为一个酶活 ’ ＩＵ( #
２ 结果与分析
样本梯度稀释后涂布于奶粉琼脂平板形成单菌 落" ３７ ,培养 １２ ｈ 和 ２４ ｈ" 挑取 ２ 次水解圈直径与 菌落直径比值都较大的单菌落进行摇瓶复筛 # １２ ｈ" ２４ ｈ 水解圈直径与菌落直径比表 １#
不同培养基对发酵的影响见图 １# 结果表明" 第 ６ 组发酵培养基的酶活最高" 其次为第 ４ 组# 可能是 牛肉膏& 蛋白胨含有丰富蛋白质能够诱导蛋白酶产
２００６ 年第 １０ 期
于宏伟$ 等& 蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
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生! 其复杂成分对产酶有促进作用" 因此选用第 ６ 组 培养基作为优化培养条件的出发培养基"
２ ｇ!Ｌ－１" Ｋ２ＨＰＯ４ １ ｇ!Ｌ－１" ＭｇＳＯ４!７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ!Ｌ－１ ［４］# ’ ２( 可溶性淀粉 ４％" 酵母浸出液 ０．５％" 牛肉膏
１％ " 蛋 白 胨 １．５％ " ＮａＣｌ ０．５％ " Ｋ２ＨＰＯ４!３Ｈ２Ｏ ０．５３％" ＮａＨ２ＰＯ４!２Ｈ２Ｏ ０．０３％ ［５］#
ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ( ｂａｃｉｌｌｕｓ( ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
蛋白酶系催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称% 它作用于蛋白质% 将其分解为蛋白胨’ 多肽及游离氨 基酸& 此酶种类繁多% 广泛存在于所有生物体内% 按 其来源可分为植物蛋白酶’ 动物蛋白酶’ 微生物蛋白 酶( 按其作用形式可分为肽链内切酶’ 肽链外切酶( 按所产蛋白酶性能分为酸性蛋白酶’ 霉菌蛋白酶’ 中 性蛋白酶和碱性蛋白酶& 目前% 蛋白酶制剂主要被用 于提高风味’ 生产抽提物’ 改善营养价值% 以及改变 物理性质等方面& 如皮革工业的脱毛和软化已大量利 用蛋白酶% 既节省时间% 又改善劳动卫生条件& 蛋白 酶还可用于蚕丝脱胶’ 肉类嫩化和酒类澄清& 临床上 蛋白酶可作药用% 如用胃蛋白酶治疗消化不良% 用酸 性蛋白酶治疗支气管炎% 用弹性蛋白酶治疗脉管炎% 用胰蛋白酶’ 胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化 及胸腔间浆膜粘连的治疗& 加酶洗衣粉是洗涤剂中的 主要产品% 含碱性蛋白酶% 能去除衣物上的血渍和蛋
收稿日期" ２００６－ ０８－ ２１ 作者简介" 于宏伟 # １９７８－ !! $ % 男% 河北人% 硕士% 研究方向" 酶工程技术&
! 为通讯作者" 贾英民% 教授% 博士生导师% 研究方向" 酶工程技术研究& Ｅｍａｉｌ" ｙｍｊｉａ＠ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ&
!６８!
农产品加工!学刊
２００６ 年第 １０ 期
于宏伟% 栗志丹% 郝珊珊% ＊ 贾英民
# 河北农业大学 食品科技学院% 河北 保定 ０７１００１$
摘要" 从养牛厂附近的土壤中分离得到一株产蛋白酶性质优良的菌株% 初步鉴定为芽孢杆菌% 对其最适产酶条件进
行 了 研 究 & 试 验 表 明 % 最 适 碳 源 为 玉 米 粉 % 最 适 氮 源 为 玉 米 浆 % ３００ ｍＬ 摇 瓶 最 适 装 液 量 为 ６０ ｍＬ% 最 适 接 种 量 为
以磷酸缓冲液 ’ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ" ｐＨ 值为 ７．５( 为底物 缓 冲 液 " 将 酶 液 在 ３０￣８０ ’下 保 温 ３０ ｍｉｎ" 测 定 其 残余酶活# １．４．５ 金属离子敏感性
以磷酸缓冲液 ’ ０．２ｍｏｌ／Ｌ" ｐＨ 值为 ７．５( 为 底 物 缓 冲 液 " 分 别 加 入 ４ ｍｍｏｌ／Ｌ 的 Ｆｅ２＋" Ｃａ２＋" Ｐｂ２＋" Ｍｇ２＋" Ｋ＋" Ｍｎ２＋" Ｃｕ２＋" 巯基 乙 醇 " ＥＤＴＡ" 测 定 其 酶 活性#
１．３．１ 种子活化及平板培养 种 子 活 化 培 养 $ ３７ ! 培 养 １８ ｈ% 平 板 培 养 $
３７ "培养 ２４ ｈ# １．３．２ 复筛发酵培养
将发酵液 ６０ ｍＬ 置于 ３００ ｍＬ 三角瓶中" 接种一 定 量 在 摇 床 上 " ３７ # " 转 速 ２ ００ ｒ／ｍｉｎ" 分 别 发 酵 １２" ２４" ３６ 和 ４８ ｈ# １．３．３ 发酵条件研究
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ% ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｃｒｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｅｒｅ" ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ% ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ% ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ； ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｑｕｏｒ ｏｆ ３００ ｍＬ ｆｌａｓｋ% ６０ ｍＬ( ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ% ２％( ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｎｄ ｗｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｗｏ ｐｅａｋｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ４．５ ａｎｄ ｐＨ ６．５． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ ｐＨ ７．５ ａｎｄ ６５ %．Ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ７．０￣９．０ ａｎｄ ｂｅｌｏｗ ５０ &% ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｂ２＋ ａｎｄ ＥＤＴＡ． Ｆｅ２＋ ｃａｎ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ａｃ－ ｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ．
在 ３７ $" ２００ ｒ／ｍｉｎ 培 养 ２４ ｈ 的 条 件 下 " 分 别 优化碳源& 氮源& 起始 ｐＨ 值& 接种量和摇瓶装量等 参数#
１．４．１ ｐＨ 值对酶活性的影响 固定温度" 以磷酸缓冲液设定 ６￣８．５ ｐＨ 值梯度"
以 ０．５ 为一梯度" 测定各个 ｐＨ 值下的酶活" 确定其 最适 ｐＨ 值# １．４．２ 温度对酶活性的影响
固定 ｐＨ 值为最 适 ｐＨ 值 " ３０￣７０ %设 定 温 度 梯 度为 １０ &" 测定酶活" 缩小温度梯度与范围" 直至 确定最适温度# １．４．３ ｐＨ 值稳定性
将酶液在 ４￣９ 的 ｐＨ 值梯度下" 室温保 温 ２４ ｈ" 以磷酸缓冲液 ’ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ" ｐＨ 值为 ７．５( 为底物缓冲 液" 测定残余酶活# １．４．４ 热稳定性
关键词" 蛋白酶( 芽孢杆菌( 酶学性质
中图分类号" ＴＱ９２０
文献标志码" Ａ
# Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ% Ｈｅｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ% Ｂａｏｄｉｎｇ% Ｈｅｂｅｉ ０７１００１% Ｃｈｉｎａ$ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｉｓｉｎｇ ｃｏｗ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ% ｗｅ ｇａｔｈｅｒｅｄ ａ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ－ ｙｉｅｌｄ
表 １ １２ ｈ" ２４ ｈ 水解圈直径与菌落直径比 样本 Ｎ９．５ １９* Ｎ１８* Ｎ２１ Ｎ１ Ｎ１* １９ ３** １２ ｈ 时比值 ４．００ ５．１８ ４．６０ ３．９１ ４．１７ ３．９２ ４．５６ ３．２１ ２４ ｈ 时比值 ４．４３ ６．４６ ８．２２ ５．１８ ５．０１ ４．８４ ５．７５ ３．９１
２００６ 年第 １０ 期
第 １０ 期（总第 ７９ 期） ２００６ 年 １０ 月
农产品加工!学刊 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｏｆ Ｆａｒｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
文章编号" １６７１－ ９６４６ （ ２００６ ） １０－ ００６７－ ０４
Ｎｏ．１０ Ｏｃｔ．
蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
白污物［１］& 本实验筛选得到了一株产中性蛋白酶的菌 株% 对其产酶条件与酶学性质作了初步研究&
１ 材料与方法
１．１．１ 菌株 从肉联厂’ 污水沟等地附近的土壤中分离得到&
１．１．２ 主要试剂和仪器 酪 蛋 白 ’ Ｓｉｇｍａ Ｃ－ ５８９０ 酪 氨 酸 % 第 二 军 医 大 学
政翔化学试剂研究所提供( 脱脂奶粉% 内蒙古伊利实 业集团股份有限公司产品( ＳＰ－ ７５６Ｐ 型紫外可见分光 光度计% 上海光谱仪器有限公司提供( ＧＬ－ ２０Ｇ－ !型 高速冷冻离心机% 上海安定科学仪器厂生产( ＰＨＳ－ ３Ｃ 型 酸 度 计 % 上 海 康 仪 仪 器 有 限 公 司 提 供 ( ＨＺＱ－ Ｑ 型旋转式恒温摇床% 哈东联电子技术开发有 限公司提供&
经发酵初筛得到 ８ 株产酶性状较好的菌株" 分别 摇瓶发酵 １２" ２４" ３６" ４８ ｈ 复筛测酶活# 结果表明" Ｎ１９ 菌株产酶性质优良稳定" 选择其作为下一步研究 的菌株#
２．２．１ 选择出发培养基 取 ６ 种芽孢杆菌发酵培养基作为优化产酶的出发
培养基" ｐＨ 值设为 ７．０# ’ １( 酪 素 ３０ ｇ!Ｌ－１" 葡 萄 糖 ４０ ｇ!Ｌ－１" 玉 米 粉
１８０
１５０
１２０
酶 Ｕ／ｍＬ
９０
６０
３０
０
１
２
３
４
５
６
wenku.baidu.com
培养基样本
图 １ 不同培养基对发酵的影响
８．０ 为发酵液的起始 ｐＨ 值进行研究$ 不同起始 ｐＨ 值 对产酶的影响见图 ４$ 由图 ４ 可知$ 当培养基的初始 ｐＨ 值为 ６．５ 和 ４．５ 时有 ２ 个产酶高峰$ 但酶活变化平 缓" 结果表明$ 起始 ｐＨ 值对产酶影响不大$ 可能是 该菌可分泌多种蛋白酶$ 在不同起始 ｐＨ 值时表达不 同蛋白酶"
１．５．１ 产胞外蛋白酶的芽孢杆菌筛选方法 将土样 １００ (水浴 １５ ｍｉｎ" 富集培养" １０ 倍 梯
度稀释后涂布于奶粉琼脂平板进行初筛# ３７ )培养 ２４ ｈ 后" 对水解 圈 直 径 与 菌 径 直 径 之 比 较 大 的 菌 落
进行摇瓶复筛" 测定发酵液蛋白酶活力［２］# １．５．２ 蛋白酶活性测定方法
１．２．１ 斜面培养基 牛 肉 膏 ５ ｇ!Ｌ－１" 蛋 白 胨 １０ ｇ!Ｌ－１" 酵 母 膏
５ ｇ!Ｌ－１" ＮａＣｌ ５ ｇ!Ｌ－１" 琼脂 ２％# １．２．２ 初筛蛋白酶选择性培养基
奶粉 １．５％" 琼脂 ２％# １．２．３ 富集" 活化及发酵培养基
牛 肉 膏 ５ ｇ!Ｌ－１" 蛋 白 胨 １０ ｇ!Ｌ－１" 酵 母 膏 ５ ｇ!Ｌ－１" ＮａＣｌ ５ ｇ!Ｌ－１#
采用 Ｆｏｌｉｎ)酚法［３］" １ ｍＬ 原发酵液加 ２ ｍＬ 质量 分 数 为 ０．５％的 酪 蛋 白 液 " 在 ｐＨ 值 ７．０" ３７ * 水 浴 １５ ｍｉｎ" 再用质量分数为 １０％的三氯乙酸灭活% 然后 取 １ ｍＬ 上述反应液的离心上清 液 " 加 １ ｍＬ Ｆｏｌｉｎ) 酚在 ５ｍＬ ０．５５ ｍｏｌ／Ｌ 的 Ｎａ２ＣＯ３ 的碱性条件下 ３７ +水 浴 １５ ｍｉｎ" 测 ６５０ ｎｍ 下的吸光值" 以加灭活酶液的 反应系统为空白#
’ ３( 豆 饼 粉 ２％ " 麸 皮 ３％ " 玉 米 粉 ４％ " Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ ０．４％ " ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３％ " ＣａＣｌ２ ０．１％ " Ｎａ２ＣＯ３!１０Ｈ２Ｏ ０．１％ ［６］#
’ ４( 牛 肉 膏 １％ " 蛋 白 胨 ０．５％ " 酵 母 膏 ０．５％ " 葡萄糖 ０．５％" ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％" ＭｇＳＯ４!７Ｈ２Ｏ ０．０２％ ［７］#
’ ５( 玉 米 粉 ５％ " 豆 饼 粉 ３％ " Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．４％ " ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３％" ＭｇＳＯ４!７Ｈ２Ｏ ０．０２％" ＣａＣｌ２ ０．３％ ［８］#
’ ６( 牛 肉 膏 ５ ｇ!Ｌ－１" 蛋 白 胨 １０ ｇ!Ｌ－１" 酵 母 膏 ５ ｇ!Ｌ－１" ＮａＣｌ ５ ｇ!Ｌ－１#