大肠杆菌离子束诱变及rpoB基因两个新的利福平抗性位点鉴定

定为 $ 区与 % 区。其中 $ 区， 即基因高保守区 "&MF &.)8 基因与右侧翼序列中截取两段， ， 包含了利福平抗性相关保守区。 % 区包含 &.)8 基因 Z 末端非保守 [ #MMM（大小 >F#\V） 区 （>"F\V，&.)8 A?"" 至 >M#F） 、 （’’\V） 和 A>\V 的 &.)8 基因与 &.)9 基因之间的非编码区 （ &.)9 基因 " 至 A>） ， 片段大小为 &AM\V。引物的设计由 ]B%KI^(BI &.)9 基因编码区片段 （ 722V： 引物序列经过 KI^(= NNL1,4G1=___# ; .2),54*8 ; 18-N6L+=\+,N:DEN_1\=V*+G1*）在线完成， 正向引物 &a=$DDD$ZDZ$ZZD$ZDD$b$ZZ$=Aa；反向引 BIEB:^D‘ 进行再次评估。 $ 区： 正 向 引 物 &a=bDZZD$ZbbZZDDbZ$D$b= 物为 &a=$D$DbbZbbZDDbbZZ$DZZ$D=Aa。 % 区： 反向引物为 &a=DbZbDZDZbbbZ$D$$$Zbb=Aa。 Aa； !") &’( 扩增和产物纯化 因产物需进行纯化与测序， KZI 反应选用 "MM H 反应体系。在 #MM H 的 KZI 薄壁 " " #c 含 (L ） ， 用无菌牙签挑取突变子克隆菌 BVV1,84*5 管中先加入 " Y :0, KZI %-551*（分装，
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斑上的菌体， 放入 !""#$%&’( 管搅动数下， 置于 )*+ 仪（ )#’,-$.!/0#’ 1233）145 630-$ 后， 添加 )*+ 反应其它组份 （预混分装）为： 6 7 !"# )*+ 89((#’， 433 0&/:; <=> ? ，正反向引物 ! 各 @4 "0&/，>33 。 0&/:; %AB)，CD 的 !"# EAF 聚合酶（ )*+ 产品均购自 BGHG+G，EG/-G$） ! )*+ 条件： 1I5 C0-$； 1I5 C3J，4K5C3J，@>5 I4J， I3 个循环； @>5 630-$。 )*+ 产物的纯 化采用 L-MG’%! NO P#/ G$% )*+ */#G$.D" NQJR#0 试剂盒 （ )’&0#=G 公司） 提供方法 （低熔点 琼脂糖挖胶回收法） 进行。 !"# 测序和序列分析 用 FST )+TN< <&%#/ C@@ EAF 测序仪完成。双 EAF 测序由大连宝生物工程有限公司， 向测序。经验 证， 未 经 诱 变 处 理 的 非 利 福 平 抗 性 菌 体 )*+ 扩 增 与 测 序 后， 与 P#$SG$, （P#$SG$, F**!NNTUA：F!333I@> V 6） 序列一致， 并以此作为比较对象， 分析突变位点。 !"$ 突变子的抗性鉴定 对目标突变子进行利福平抗性重复检验， 在终浓度为 643 =:0; ;S 利福平培养基上 ! 不明显影响存活。
离子束特别是低能氮离子束对微生物与植物种子有很强的致突变作用， 并被应用于
［&］ 。但低能氮离子束诱变的特 微生物诱变及植物育种研究， 取得巨大的经济与社会效益 ［$］ 异性及其相关机制研究尚有待完善。杨剑波等 利用 %&’( 构建子裸露 +1F 辐照后转染
大肠杆菌， 并对回复突变子进行了序列分析， 得出一些有意义的结果。但 +1F 分子在活 体细胞内与多种蛋白质结合， 并具有不同的构象。本研究旨在通过建立活体细胞内离子 束诱发 +1F 序列突变分析的方法， 鉴定活体细胞内 +1F 序列特别是碱基置换型突变谱。
突变谱研究的方法体系。在此过程中， 获得了大量的利福平抗性突变子以及相对应的突 变谱。本文同时报道了发现的 !"#$ 基因两个新的利福平抗性决定位点。
基金项目： 国家自然科学基金重大项目 （&232%"%%）
" 通讯作者。 4,)： 3#566&5662$&32； 789： 3#566&5662&"&%； :5.8;)： <)=>? ;@@ * 8-* -A
大肠杆菌离子束诱变及 ’.(/ 基因 两个新的利福平抗性位点鉴定
谢传晓 姚建铭 潘仁瑞 吴李君 余增亮"
（中国科学院等离子体物理研究所 离子束生物工程学重点实验室 合肥 $"%%"&）
摘
要： 以#% D(5 研究了低能氮离子诱发大肠杆菌利福平抗性突变。 !射线辐照为参照体系，
结果表明， 低能氮离子注入具有损伤轻而突变率较高的特点。碱基置换型突变与其检出频率 分析表明， DE# 4F、 ED# F4、 F4# ED 转换与 F4# 4F 颠换为低能氮离子诱发大肠杆菌活体细 胞内的高频突变， 占检出总突变数的 3BG6H（BBI33） 。并鉴定出大肠杆菌 !"#$ 基因中两个新 （ JE） 被胞嘧啶脱氧核苷酸 的利福平抗性决定位点。位点一位于 &66& 位鸟嘌呤脱氧核苷酸 （JD） 取代， 导致 E)A6&B（谷氨酰胺残基）被 K;L（组氨酸）替代； 位点二位于 &#2$ 的胞嘧啶脱 氧核苷酸 （ JD） 被胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （ J4） 替代， 导致 M0(6#!（脯氨酸残基）被 N,>（亮氨酸） 取代， 使突变子产生抗性。其中位点一还未见报道， 位点二的同义突变已有报道， 但 &#2$ 位 点 D 到 4 的核苷酸突变并没有得到鉴定。 关键词： 离子束诱发突变，利福平抗性， 大肠杆菌， !"#$ 基因 中图分类号： O2""， O#2& 文献标识码： F 文章编号： %%%&5#$%2（$%%"）%#5%B"$5%3
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,’- 扩增 挑取氮离子与23 *&. 加上 63 个对照菌体， "射线辐照诱发的大肠杆菌突变子各 43 个，
进行了菌体直接高保真 )*+ 扩增， 图 > 显示 @ 个突变子菌体 $%&’ 基因 F 区扩增结果。经 过对复性温度的选择、 （最终的相关反应体系与程序见本 )*+ 反应体系与反应程序的优化后 文材料与方法） ， 选定的相关 )*+ 方法适合本试验要求， 突变子扩增的成功率在 14Y 以上。
图!
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低能氮离子注入 （*） 与#& ’() （+） 辐照后大肠杆菌的存活曲线及突变率 !射线
（ F） （ S） N9’\-\G/ (’GXR-&$J G$% 09RG$R (’#]9#$X-#J -$%9X#% 8Q /&^ #$#’=Q A ? 8#G0 -0"/G$RGR-&$ G$% 23 *&. -’’G%-GR-&$ "
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谢传晓等： 大肠杆菌离子束诱变及 !"#$ 基因两个新的利福平抗性位点鉴定
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!"# 低能氮离子诱发大肠杆菌体内特异性碱基 置换突变 突变子扩增后的产物进行测序， 与其野生型 序列进行比对， 得突变位点、 发生频率及其相关信 息总结 （表 !） 。低能氮离子诱变得到的 "# 个利 福平抗性突变子中， 共检出了 $$ 个突变， 大多数 突变子 （%& 个） 能检出 ! 个突变位点， 至多 ’ 个突 变位点。其中 $( 个为碱基置换型突变， ! 个单 ) 插入突变， 各种突变检出频率参见表 ! 相关数据。 从突 变 类 型 与 其 检 出 频 率 分 析， *+ ! ),、 +* ! ,)、 ,)!+* 转换与 ,)! ), 颠换为低能氮离子诱 发高频突变， 占检出总突变数的 $(-". （((/$$） 。
［"， !］ 。大肠杆菌 !"#$ 基因编码 P1F 聚 抗生素利福平有抑制细菌 P1F 聚合酶的功能 合酶"亚基， !"#$ 基因内部碱基置换型突变可以改变 P1F 聚合酶与利福平的结合特性， ［"， 6］ 。 !"#$ 基因全长 !%$2/@，但已有的研究表明， 与利福平抗 从而表现出对利福平的抗性 ［ ］ 总长不过 &BB/@。$2 个位点中发生 性相关的位点集中于两个区域， D)>LQ,0 R 与 D)>LQ,0 RR " ， （个） 单 碱 基 置 换 引 起 的 $& 种 氨 基 酸 残 基 改 变 可 以 导 致 大 肠 杆 菌 利 福 平 抗 的 !B 种 ［"， #， B］ 。我们利用大肠杆菌利福平抗性突变谱丰富的特点， 建立了作为物理、 化学诱变剂 性
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结果
低能氮离子与#& ’() !射线辐照存活和突变子频率 统计结果表明： 低能氮离子注入与 "射线辐照后， 大肠杆菌利福平抗性突变子的频率
大大提高。两种诱变剂的存活与突变实验表明， 低能氮离子注入对大肠杆菌具有损伤轻 而突变率高的特点 （图 6） 。当低能氮离子的注量为 4W> 7 636I -&$J:X0> 时与 63 PQ "射线处 理细胞后， 具有相近存活细胞分数 （约 23Y ） 。但在此剂量下， 低能氮离子注入组突变子 检出频率约为23 *&. 分别达到 1WI 7 63 Z @ 与 1WC 7 63 Z K 。表明低能氮离 "射线辐照的 63 倍， 子与 "射线相比， 在同等细胞致死条件下， 突变作用 （本筛选指标下的） 相对较大的特点。
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材料和方法
材料
大肠杆菌 （ !"#$%&’#$’( #)*’ ） 菌株选用 !"# $%""&’ 菌株， 由美国 ()*+,-. 教授 !"!"! 菌株： = （/,+01*.+23 45 ()..)67-.122. (18+6)9 :67449 ; /:$）惠赠，基因型为 < +$&= " (&(= "> *%, %? ! （ -.+= .&) $） （ $:）-(* !# （ C6）$’" D> （ C6）&01 E" 2-* =&" &.) :AF? （ $G） ?# *(# @" +"/= AA ",. B>> （ :2*I ）34- !&" /5* $& 2+*= " (&- BA （C6）+$’ ="。 &." HA" ［J］ 配制， 试剂均为国产分析纯。 !"!"# 培养基： H% 培养基与 (( 培养基按文献 利福平（色谱纯， 链霉 !"!"$ 试剂和仪器： K*4G1L) 公司产品）的使用终浓度为 "&M LNGH， " 素 （色谱纯， K*4G1L) 公司产品）的使用终浓度为 AM LNGH。其它试剂为国产分析纯。 " 氮离子注 入 装 置 为 中 国 科 学 院 等 离 子 体 物 理 研 究 所 本 单 位 研 制 （专 利 号 OH FA ； "MAA?" ; ?） #射线装置为安徽省农业科学院原子能研究所的 <PQ=>A# 型。 !"# 菌株的培养和辐照诱变处理 从平板上挑取单菌落在含链霉素液体 "MGH H% 培养基上 A’R ##M*NG+, 过夜 （"?7）培 培养至对数初期 （ 67?MM 约为 MTA， 养， " S "MM 接种于新鲜的 H% 培养基中， %16UG), E/?>M 检 收集菌体， 在 测仪测定） 。"MGH 培养液 &MMM*NG+, 离心 #G+,， "GH K%:（ VW’TM）溶液重悬， 平皿中接受 辐 照 处 理。辐 照 离 子 选 用 "MU1X 氮 离 子， 最 终 突 变 筛 选 注 量 为 &T# Y "M"> 脉冲式注入（脉冲注入时间 &.，中间间隔 "M.） 。同时， 利用相同致死率的 "MD3 +4,.N6G# ， ?M 的 Z4= 射线辐照体系结果作为参比体系。通过预实验确定存活分数， 按存活率决定稀释 # 倍数， 以每平板 （直径 F6G） 生长 "MM [ AMM 个菌落为宜。 !"$ 突变子的筛选和突变率计算 处理与对照用 K%: 溶液洗下， 取其中 &M H 涂 H% 利福平平板。同时取稀释 "M? 至 "M’ " 倍的菌液涂 (( 平板以确定存活细菌数。所有平板均 A’R 培养（"? [ #>7 后）统计突变 子数与存活细菌数。每个剂量的处理与对照均设 A 个重复。突变率为处理突变子个数平 均值除以细胞总个数的均值。 !"% &’( 扩增区域及 &’( 引物的设计和评估 为了获得一些利福平抗性决定与非抗性决定区域的突变谱信息。 KZI 扩增区域选择
作者简介： 谢传晓 （&2B$ C ） ， 男， 安徽怀宁人， 在读博士生， 研究方向为辐射诱变机理。 :5.8;)： -99;,? ;@@ * 8-* -A 收稿日期： $%%$5&$5"%，修回日期：$%%"5%#5$"
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谢传晓等： 大肠杆菌离子束诱变及 &.)8 基因两个新的利福平抗性位点鉴定