【学习课件】第三章基因克隆与表达的载体
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Low molecules and multiple copies （6）容易从宿主细胞中分离纯化。
Easy isolation andpppt课u件 rification from host cells. 6
3.基因工程对载体的要求－组成部分
克隆载体 表达载体
复制位点 选择性标记 克隆位点
表达调控元件
前提条件：只有在确实证明第二种质粒B已经进入
含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主
细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳
定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的
质粒。
ppt课件
19
3. 质粒的转移性 在大肠杆菌中的质粒，可以分为：
（1） 接合型质粒
能自我转移
（2） 非接合型质粒
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
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9
大肠杆菌的质粒
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10
（一）质粒（ Plasmid ）的命名
质粒的命名规则
① 天然存在的质粒：其符号的第一个字 母要大写，并不用斜体字，书写时要 用括号括起来，如（ColE1）。
② 重组质粒：通常是用小写p后加两个大
写字母表示.
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1
第三章 基因克隆与表达的载体
vectors
ppt课件
2
基因克隆过程
？vectors 本质？
ppt课件
3
1. 载体 (Vectors)
在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体 细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
载 体 的 本 质 是 DNA 。 经 过 人 工 构建的载体，不但能与外源基 因相连，导入受体细胞，而且 还能利用本身的调控系统使外 源基因在新的细胞中复制。
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15
② 开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
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16
（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC l DNA
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4
载体的功能：
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries.
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必 须 的
7
3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有4类：
质粒（plasmid）
单链DNA噬菌体M13
噬菌体的衍生物
柯斯质粒（cosmid）
动物病毒（virus）
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8
第一节 克隆载体
一、质粒（plasmid）
存在于多种宿主细胞中、独立于染色体以外的可自主复 制的双链闭合环状DNA分子。
拷贝数多，一般10个以上。
（非接合型质粒分子量pp小t课件 ，一般属松弛型）。
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2. 不相容性 （incompatibility）
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不 同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在 细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀释 )掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。
（一）质粒（ Plasmid ）的命名
例如：pSC101
质粒试验 研究类号
plasmid 质粒
Stanley Cohen
构建质粒的研究人员或完
ppt成课件此项工作的研究机构
12
（二） 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1-200 kb
质粒DNA仅占细胞染色体组一小部分，一般约1％-3％左右。
不同质粒DNA的分子量差异相当显著，质粒DNA分子小的不足 2 kb，大的可达100 kb以上，多数在10 kb左右。最小的仅能 编码2—3种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。
分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求
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21
大肠杆菌接合（conjunction）
ppt课件
22
Donor cell
Conjugative plasmid
Recipient cell
Pilus 菌毛
Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.
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13
（二） 质粒的一般生物学特性
（2）编码基因少：
2-3个中等大小的蛋白质。 如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。
（非必须）
（3）环状：
双链环状DNA。
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14
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
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（ 2）非接合型质粒（non-conjugative plasmid ）
虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控 制细菌配对和质粒接合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ移的基因，因此不能从一 个细胞转移到另一个细胞。
SC
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（三）质粒的基本性质
1. 复制
p39
质粒的拷贝数 ：指在正常生长条件下，每个细菌细
胞或每条染色体所对应的平均质粒数。
（1） 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1-3个拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）
（2） 松弛型质粒（relaxed plasmid）
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5
2. 基因工程对载体的要求
（1）具有对受体的可转移性。transferable （2）在宿主细胞内能独立复制。
replicate independently in host cell （3）有一段多克隆位点。 Multiple cloning sites
外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）有选择性标记。 selectable marker （5）分子量小，拷贝数多。
不能自我转移
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（1） 接合型质粒（conjugative plasmid）
通过接合作用转移到新宿主内，又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因
如：F质粒（性质粒、或F因子）： 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到 原先不存在该质粒的受体菌中。
Easy isolation andpppt课u件 rification from host cells. 6
3.基因工程对载体的要求－组成部分
克隆载体 表达载体
复制位点 选择性标记 克隆位点
表达调控元件
前提条件：只有在确实证明第二种质粒B已经进入
含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主
细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳
定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的
质粒。
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3. 质粒的转移性 在大肠杆菌中的质粒，可以分为：
（1） 接合型质粒
能自我转移
（2） 非接合型质粒
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
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大肠杆菌的质粒
ppt课件
10
（一）质粒（ Plasmid ）的命名
质粒的命名规则
① 天然存在的质粒：其符号的第一个字 母要大写，并不用斜体字，书写时要 用括号括起来，如（ColE1）。
② 重组质粒：通常是用小写p后加两个大
写字母表示.
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第三章 基因克隆与表达的载体
vectors
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2
基因克隆过程
？vectors 本质？
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1. 载体 (Vectors)
在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体 细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
载 体 的 本 质 是 DNA 。 经 过 人 工 构建的载体，不但能与外源基 因相连，导入受体细胞，而且 还能利用本身的调控系统使外 源基因在新的细胞中复制。
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15
② 开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
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（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC l DNA
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载体的功能：
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries.
ppt课件
必 须 的
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3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有4类：
质粒（plasmid）
单链DNA噬菌体M13
噬菌体的衍生物
柯斯质粒（cosmid）
动物病毒（virus）
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第一节 克隆载体
一、质粒（plasmid）
存在于多种宿主细胞中、独立于染色体以外的可自主复 制的双链闭合环状DNA分子。
拷贝数多，一般10个以上。
（非接合型质粒分子量pp小t课件 ，一般属松弛型）。
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2. 不相容性 （incompatibility）
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不 同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在 细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀释 )掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。
（一）质粒（ Plasmid ）的命名
例如：pSC101
质粒试验 研究类号
plasmid 质粒
Stanley Cohen
构建质粒的研究人员或完
ppt成课件此项工作的研究机构
12
（二） 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1-200 kb
质粒DNA仅占细胞染色体组一小部分，一般约1％-3％左右。
不同质粒DNA的分子量差异相当显著，质粒DNA分子小的不足 2 kb，大的可达100 kb以上，多数在10 kb左右。最小的仅能 编码2—3种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。
分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求
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大肠杆菌接合（conjunction）
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Donor cell
Conjugative plasmid
Recipient cell
Pilus 菌毛
Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.
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（二） 质粒的一般生物学特性
（2）编码基因少：
2-3个中等大小的蛋白质。 如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。
（非必须）
（3）环状：
双链环状DNA。
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（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
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（ 2）非接合型质粒（non-conjugative plasmid ）
虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控 制细菌配对和质粒接合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ移的基因，因此不能从一 个细胞转移到另一个细胞。
SC
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（三）质粒的基本性质
1. 复制
p39
质粒的拷贝数 ：指在正常生长条件下，每个细菌细
胞或每条染色体所对应的平均质粒数。
（1） 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1-3个拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）
（2） 松弛型质粒（relaxed plasmid）
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2. 基因工程对载体的要求
（1）具有对受体的可转移性。transferable （2）在宿主细胞内能独立复制。
replicate independently in host cell （3）有一段多克隆位点。 Multiple cloning sites
外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）有选择性标记。 selectable marker （5）分子量小，拷贝数多。
不能自我转移
ppt课件
20
（1） 接合型质粒（conjugative plasmid）
通过接合作用转移到新宿主内，又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因
如：F质粒（性质粒、或F因子）： 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到 原先不存在该质粒的受体菌中。