第九章 亲和纯化技术
亲和纯化
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。
可供选择的载体
❖ 琼脂糖凝胶
过滤介质均 可作为亲和配基的载体
❖ 蛋白质参与亲和作用的机理
一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点， 呈凹陷或凸起结构。
具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的 各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、 疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。
生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是 亲和作用特异性高的主要原因。
二、影响亲和作用的因素
第四节 亲和吸附平衡 （略）
第五节 亲和色谱过程分析
❖ 亲和色谱操作过程
上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生
1、进料吸附（p329)
亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：
❖ 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） ❖ 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）
概述
❖ 生物亲和作用（bioaffinity）
定义： 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种 特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。
通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。
配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为
E＋L E·L
结合常数
Keq
E L EL
结合常数越大，表示 亲和作用越强
其中：E、L和E·L分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困 难，太小则难于有效吸附目标物质。
串联亲和纯化法
串联亲和纯化法
亲和纯化是一种利用毒物与固定结合基的吸附作用，将溶液中的污染物从水中萃取出来，以达到较高的处理效果的技术。
1、原理：亲和纯化技术主要利用水溶液中污染物与某些复杂化学物质结合，
以实现将污染物从水中分离。
该技术可以有效解决水中有机污染物（如硫醇、杂芳香族烃、芳香类胺类、有机磷酸盐等）以及重金属离子等的污染问题。
它通常是通过某种固定结合基（如碱性团聚水合物材料）将复杂污染物分离出来，让污染物在当量的复杂溶液中黏结聚集，从而实现对溶液中污染物的萃取。
2、过程：亲和纯化主要包括以下步骤：
（1）向反应系统中加入一定的固定结合基；
（2）将反应系统中的污染物吸附到此固定结合基上；
（3）从反应系统中移除污染物，以达到污染物消减的目的；
（4）回收得到的固体固定结合基；
（5）处理后的溶液再次进行清洗，以消减可能存在的有机物。
3、应用：亲和纯化技术在工业废水处理上是不可替代的，广泛应用于食品、
制药、化工、石油等工业生产过程中的各种废水处理，也有针对各种单一的污染物的处理，如废水中有机污染物、重金属离子等。
它不仅可以帮助企业在改善水质事业中发挥着重要作用，也能帮助工厂在节能、降耗、减排上发挥重要作用。
4、优势：
（1）效率高：比其他水处理技术效率还要高，可以有效处理各种水中的污染物，
主要用于去除废水中的有机物和重金属。
综上所述，亲和纯化技术是一项有效、安全、可靠的水处理技术，用于清除、净化企业的废水，可以有效解决水中有机污染物、重金属离子等的污染问题。
因此，亲和纯化技术在工业废水处理和污染的控制中起着不可替代的作用。
亲和力分离纯化技术的研究现状与发展
亲和力分离纯化技术的研究现状与发展亲和力分离纯化技术被广泛用于生物大分子的纯化，例如酶、抗体、蛋白质和核酸等。
该技术采用静电作用、亲和力和其他特殊性质分离靶分子，从而使杂质分子与靶分子分离。
本文将探讨该技术的研究现状和发展。
一、常见的亲和力分离纯化技术亲和力分离纯化技术的类别很多。
目前最常用的技术包括以下几种：亲和层析（Affinity Chromatography）、金属螯合层析（Metal Chelate Chromatography）、离子交换层析（Ion-Exchange Chromatography）、亲水相亲和层析（Hydrophobic Interaction Chromatography）和逆相高效液相色谱层析（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography）。
亲和层析是一种基于化学亲和力的纯化方法。
特定的分子（例如抗体和金属螯合酰胺等）和受体之间的化学亲和力使这些分子紧密结合。
该方法可对天然蛋白质、生物大分子和有机分子进行有效的分离。
然而，该技术具有ET-buffer的pH和离子强度等缺陷。
金属螯合层析是一种吸附介质上阴离子络合物毛细管电泳（CEX-HPLC）的变体。
该技术利用螯合吸附剂上金属离子的络合性质，吸附含有亲和基团的靶分子。
然而，该方法不适用于低亲和力分子的纯化。
离子交换层析是一种基于荷电性质的纯化技术。
在这种过程中，杂质分子通过与固定相上的离子交换基团产生相互作用而被分离，而靶分子通过不互相作用的交换基团而流过。
该方法广泛应用于从树脂中去除不需要的离子，并从大量分析样品中纯化DNA碎片、蛋白质和其他生物大分子等。
亲水相亲和层析是一种生物分子纯化技术，可在低离子强度的缓冲液中使用。
该方法通常用于具有高表面亲和性的表面上部分唾液蛋白和醣蛋白质的纯化。
逆相高效液相色谱层析是一种常见的离子交换技术，用于纯化蛋白质、多肽和核酸。
生物制药工艺学习题(含答案
生物制药工艺学习题集（含答案）第一章生物药物概述一、填空：1、我国药物的三大药源指的是化学药物、生物药物、中药2、现代生物药物已形成四大类型，包括基因重组多肽和蛋白质、基因药物、天然生化药物、合成与部分合成的生物药物3、请写出下列药物英文的中文全称：IFN（Interferon）干扰素、IL(Interleukin)白介素、CSF（Colony Stimulating Factor）集落刺激因子、EPO（Erythropoietin）促红细胞生成素、 EGF（Epidermal Growth Factor）表皮生长因子、NGF（Nerve Growth Factor）神经生长因子、 rhGH（Recombinant Human Growth Hormone）重组人生长激素、Ins（Insulin）胰岛素、HCG（Human Choriogonadotrophin）人绒毛膜促性腺激素、 LH 促黄体生成素、SOD超氧化物歧化酶、tPA 组织纤溶酶原激活物4、常用的β-内酰胺类抗生素有青霉素、头孢菌素；氨基糖苷类抗生素有链霉素；大环内酯类抗生素有红霉素；四环类抗生素有土霉素；多肽类抗生素有杆菌肽；多烯类抗生素有两性霉B；蒽环类抗生素有阿霉素5、嵌合抗体是指用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区；人源化抗体是指抗体可变区中仅CDR（决定簇互补区）为鼠源，其FR（骨架区）及恒定区均来自人源。
6、基因工程技术中常用的基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。
二、选择题：1、以下能用重组DNA技术生产的药物为（B）A、维生素B、生长素C、肝素D、链霉素2、下面哪一种药物属于多糖类生物药物（C）A、洛伐他汀B、干扰素C、肝素D、细胞色素C3、能用于防治血栓的酶类药物有（D）A、SODB、胰岛素C、L-天冬酰胺酶D、尿激酶4、环孢菌素是微生物产生的（A）A、免疫抑制剂B、酶类药物C、酶抑制剂D、大环内酯类抗生素5、下列属于多肽激素类生物药物的是（D）A、ATPB、四氢叶酸C、透明质酸D、降钙素6、蛋白质工程技术改造的速效胰岛素机理是（D）A. 将猪胰岛素B30位改造为丙氨酸，使之和人胰岛素序列一致B. 将A21位替换成甘氨酸，B链末端增加两个精氨酸，使之在pH4溶液中可溶C. 将B29位赖氨酸用长链脂肪酸修饰，改变其皮下扩散和吸收速度D. 将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换，使之不易形成六聚体三、名词解释：1、药物 Medicine(remedy)：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药2、生物药物（biopharmaceutics）：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物3、基因药物（gene medicine）：是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等4、反义药物：是以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列，它能与模板DNA或mRNA互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA翻译，从而达到抗肿瘤和抗病毒作用5、生物制品（biologics）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品6、RNA干涉（RNAi，RNA interference）：是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程7、siRNA(small interfering RNA) ：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。
11第九章--亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
48
碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
49
（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
62
非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
63
离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
64
疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
19
（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
20
1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
串联亲和纯化技术原理
串联亲和纯化技术原理引言：串联亲和纯化技术是一种用于分离和纯化蛋白质的常用方法。
其原理是利用特定的亲和配体与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现目标蛋白质的高效分离和纯化。
本文将详细介绍串联亲和纯化技术的原理及其在生物制药和生物学研究中的应用。
一、串联亲和纯化技术的基本原理1. 亲和配体的选择串联亲和纯化技术的第一步是选择适合的亲和配体。
亲和配体是一种能够与目标蛋白质特异性结合的分子，它通常是一种蛋白质或化学修饰物。
常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标签等。
2. 亲和柱的制备与校正根据选择的亲和配体，可以制备相应的亲和柱。
亲和柱是一种固定了亲和配体的柱状基质，如琼脂糖、硅胶等。
为了确保亲和纯化的高效性和特异性，亲和柱需要进行校正，以确定适宜的结合和洗脱条件。
3. 样品的处理与加载在进行串联亲和纯化之前，需要对样品进行预处理。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、富集等步骤。
预处理后的样品被加载到亲和柱上，目标蛋白质与亲和配体发生特异性结合。
4. 洗脱与再生洗脱是将目标蛋白质从亲和柱上洗脱下来的过程。
洗脱条件通常是改变pH值、离子浓度、温度等。
洗脱得到的蛋白质溶液即为目标蛋白质的纯化产物。
亲和柱在洗脱后需要再生，以去除非特异性结合的杂质。
二、串联亲和纯化技术在生物制药中的应用1. 蛋白质药物的纯化串联亲和纯化技术广泛应用于蛋白质药物的纯化过程中。
通过选择适当的亲和配体，可以高效地纯化目标蛋白质药物，并去除其他蛋白质、核酸、小分子等杂质。
这种方法具有高效、特异性好、纯化度高等优点，可以满足药物的高纯度要求。
2. 疫苗的制备串联亲和纯化技术也可用于疫苗的制备。
例如，通过将目标抗原蛋白质与亲和配体结合，可以高效地纯化目标抗原，然后将其制备成疫苗。
这种方法可以提高疫苗的纯度和效力，减少潜在的副作用。
三、串联亲和纯化技术在生物学研究中的应用1. 蛋白质相互作用的研究串联亲和纯化技术在研究蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。
生物制药工艺学习题第九章亲和纯化技术
第九章亲和纯化技术一、填空题1、亲和层析洗脱方法有，，。
2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。
3、亲和层析中常用作别离酶的配基有，，和。
4、亲和层析中非专一性吸附有、、。
5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和两大方法。
二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的选项是〔〕A.载体必须能充分功能化。
B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。
C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。
D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。
2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是〔〕A.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中参加配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 竞争洗脱D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 正洗脱D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取〔Affinity-based resersed micellar extraction〕：2、亲和膜：3、二次作用亲和沉淀〔secondary-effect affinity precipitation〕：4、亲和萃取：5、亲和吸附剂：6、负洗脱：四、问答题1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？2、对亲和层析的公式 LK L V Ve ][100+= 进展说明。
设 K L =10-7，求[L 0] 〔6分〕 3、何谓“手臂〞？其长短与亲和层析效果有何联络？为什么？4、从亲和沉淀的机理和别离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。
第九章 亲和纯化技术〔答案〕一、填空题1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。
2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、配基构造 等。
第九章其它亲和技术
第三节其他亲和纯化技术一、亲和过滤（膜分离）二、亲和分配（双水相萃取）三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取）四、亲和沉淀（沉淀分级）五、亲和电泳（电泳）一、亲和过滤（Affinity Filtration）将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。
亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。
亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration）基质及大分子亲和配基基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。
配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体；用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。
基质聚丙烯酰胺菌类的完整细胞（酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞）琼脂糖、脂质体等酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A亲和膜（affinity membrane）亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。
将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。
亲和膜优点传质阻力小，达到吸附平衡的时间短；配基利用率高，配基用量低；压降小，流速快；设备体积小。
二、亲和萃取（Affinity extraction）定义：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。
PEG/Dextran,PEG/无机盐m A目标分子的亲和分配系数T和B分别表示上相和下相；m A和m O为有、无配基时目标分子的分配系数；m L为配基的分配系数；C L为配基浓度；K d为配基与目标分子反应的解离常数。
上相配基浓度CLT 越高，mA越大亲和萃取纯化过程亲和分配（进料），杂蛋白反萃取（清洗）目标产物反萃取（洗脱）。
亲和纯化
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小， 3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经 配基偶联后， 凝胶膨胀度会进一步变小， 配基偶联后 ， 凝胶膨胀度会进一步变小 ， 所以应用受到 限制。 限制。 聚丙烯酰胺凝胶： 碳骨架， 4） 聚丙烯酰胺凝胶：碳—碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双 碳骨架 丙烯酰胺聚合而成， 具有网状三维空间结构。 丙烯酰胺聚合而成 ， 具有网状三维空间结构 。 注意避免 接触强氧化剂， 配基偶联后会使它的网格缩小， 接触强氧化剂 ， 配基偶联后会使它的网格缩小 ， 在一定 程度上限制了它的应用。 程度上限制了它的应用。
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强， 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主 要用于分离与核酸有关的物质。 要用于分离与核酸有关的物质。 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 这类载体能使吸附物质保持活性， 这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。
(四)亲和层析的基本操作
(二)
洗脱方式
1,一步洗脱 一步洗脱 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 属于非选择性洗脱方法， 的结合， 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 就可得到较纯的分离物。 来，就可得到较纯的分离物。 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、温度 pH 和介电常数等因素的影响， 和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变 被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。
《生物制药工艺学》第9章亲和纯化技术
20
（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。 ，
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基
载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
21
（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用
配基。 • 特殊配基（special ligand）
• 具有离子基团的亲和 吸附剂会影响蛋白质的 洗脱行为。
51
疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
52
复合亲和力
• 离子效应作用，又有疏水作用。 • 配体与配基有较强生物特异性。 • 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高
酚、醇类等偶联。 •
31
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其 它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 ( 含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
32
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。 • 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
33
叠氮化法
• 聚 丙 烯 酰 胺 的 酰 肼 衍 生 物 ， 加1mol/L的亚 硝酸，反应液搅90s；
化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
24
（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
25
溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。
• 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
125453-专升本插班生考试-028制药工程专业-生物制药工艺学-考试大纲
吉林大学珠海学院2019年本科插班生招生入学考试《制药工程》专业考试大纲考试科目名称：生物制药工艺学一、考试的内容、要求和目的1、考试内容：（考核比重：35%）第一章生物药物概述一）学习目的与要求1、掌握生物药物概念、性质、特点与研究范围。
2、熟悉现代生物药物的分类和用途。
3、了解生物制药工业的历史、现状和发展前景。
二）考核知识点1、识记：生物药物，基因工程药物，基因药物，生化药物，微生物药物，生物制品等的概念；生物药物的类别。
2、理解：生物药物的性质和作用特点；基因工程药物与基因药物的区别；生物药物的发展前景与方向。
3、应用：生物药物的应用范围；DNA重组药物的应用范围；生物药物的发展与药学发展的关系。
第二章生物制药工艺技术基础一）学习目的与要求1、掌握生物活性物质的特点。
2、掌握生物活性物质制备的步骤及提取、浓缩与干燥方法。
3、了解中试放大工艺设计特点方法和内容。
二）考核知识点1、识记：生物活性物质的存在特点；微生物纯培养，诱变育种，核酸疫苗等概念；2、理解：各种制备方法的异同及诸多因素对生化物质溶解度的影响；以及提取的方法和工艺要点；基因工程制药的基本内容；微生物菌种保藏和防止菌种退化的方法；生物药物分离纯化的原理。
3、应用：DNA重组体的几种主要表达系统和特点；第三章生物材料的预处理和液固分离一）学习目的与要求1、掌握常用细胞破碎的方法，各种方法的优缺点和适用范围。
2、熟悉生物材料预处理的目的，去除杂蛋白、多糖和金属离子的方法和原理。
3、了解液固分离的方法和设备。
二）考核知识点1、识记：常用细胞破碎的方法；凝聚作用和絮凝作用；过滤和离心分离的概念。
2、理解：细胞破碎的方法和各自特点、适用范围。
细胞培养液的预处理方法和原理；去除杂蛋白、多糖和金属离子的方法和原理；影响液固分离的因素。
3、应用：举例说明不同生物材料的细胞破碎方法；错流过滤的使用特点。
第四章萃取法分离原理一）学习目的与要求1、掌握溶剂萃取的基本原理，萃取方式，破乳化方法。
免疫亲和纯化和免疫沉淀概要
免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优 化组合。
常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。
1．亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须 符合以下要求：①非特异性吸附低；②液体通过 时流速要快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳 定；④必须有合适的、丰富的化学基团，能有效 地与蛋白质或其它化合物结合；⑤必须带有丰富 的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的 支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其 中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。
特点： 1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。 2、由于内在的背景限制，如目标抗原量非常稀少，需与其他方法结 合才能获得均质性产物。 3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不同规模进行，半 天内即可完成。 4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至 所有能与相应配体有效结合的生物分子。 5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天 然状态或近似天然状态的抗原。 6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析， 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。
影响免疫亲和层析纯化效果的因素
抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度 极为重要的因素。
抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最 麻烦的问题。高亲和力抗体（>10-8 mol/L)能在1 h以内 达到有效的分离，而低亲和力的抗体(﹤10-6 mol/L）即 使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针 对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方 法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。 只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多 个表位的抗体。
超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手
生物制药工艺学总结(大致按要求整理)
生物制药工艺学名词: 10个20分；选择10个10分；填空10个20分；简答5个30分；论述2个20分。
第一章生物药物概述1.药.、生物药物、生物制品药物：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质, 有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
生物药物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．, ．综合应用生物与医学、生物化学与分．．．．: ．是利用生物体、生物组织、细胞或其成分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一大类预防、诊断、治疗和康复保健的制品。
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．广义: 从动物、植物、微生物和海洋生物为原料等制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物；还包括生物工程技术制造生产的新生物技术药物。
医学生物制品：一般指：用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病的免疫制剂, 主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品等。
《新生物制品审批办法》生物制品定义: 是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的, 用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
2..基因重组药物（基因工程药物）与基因药物有什么区别？基因重组药物属于基因工程药物, 这类药物主要是应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。
而基因药物不是基因工程药物, 这类药物是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础, 包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
第二章生物制药工艺技术基础1.生化制药制备工艺的六个环节（1）原料的选择和预处理2）原料的粉碎（3）提取: 从原料中经溶剂分离有效成分, 制成粗品的工艺过程。
第九章_亲和色谱
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
28694生物制药工艺学课程考试说明
28694 生物制药工艺学课程考试说明一、本课程使用的教材、大纲生物制药工艺学课程指定使用的教材为《生物制药工艺学》（附大纲），吴梧桐主编，中国医药科技出版社，第二版。
二、本课程的试卷题型及试题难易程度1.试卷题型结构表2.试卷分别针对了解、领会、掌握、熟练掌握四个认知及能力层次命制试题，四个层次在试卷中所占的比例大致为了解占20%，领会占30%，掌握占30%，熟练掌握占20%。
3.试卷难易度大致可分为容易、中等偏易、中等偏难、难四个等级，试卷中不同难易度试题所占的分数比例，大致为容易占20%，中等偏易占30%，中等偏难占30%，难占20%。
三、各章内容分数的大致分布根据自学考试大纲的要求，试卷在命题内容的分布上，兼顾考核的覆盖面和课程重点，力求点面结合。
教材具体各章所占分值情况如下：四、考核重点及难点第一章生物药物概述（1）生物药物的概念和分类；（2）生化药物和生物制品的概念；（3）生物药物的药理学特性。
第二章生物制药工艺技术基础（1）生化制药的生物材料来源；（2）生物药物的制造工艺过程；（3）生物材料的选择原则；（4）影响生化活性物质提取效率的因素；（5）生化活性物质的浓缩方法；（6）生化制药工艺中分离制备方法的基本原理；（7）菌种的退化与防止方法；（8）灭菌与除菌方法；（9）微生物发酵方法与发酵过程的重要影响参数与控制；（10）基因工程制药技术基础；（11）固定化酶的概念与制备方法。
第三章生物材料的预处理、细胞处理和液-固分离（1）细胞与蛋白质的凝聚处理。
第四章萃取分离（1）萃取、反萃取、分离因素的概念及意义；（2）影响溶剂萃取的因素；（3）双水相萃取的概念；（4）反胶束萃取的概念、原理及萃取过程。
第五章固相析出分离法（1）盐析法概念、基本原理、优缺点及操作的注意事项；（2）有机溶剂沉淀概念、基本原理及优缺点；（3）等电点沉淀法的基本原理；（4）晶体大小的影响因素。
第六章吸附分离法（1）吸附分离、吸附剂的概念；（2）吸附分离的原理及影响因素。
生物制药工艺学第9章亲和纯化技术08-04-16
一、亲和层析的原理
（1）配基固定化：配基与 载体偶联，结合成具有特 异亲和性的分离介质。
（2）吸附样品：亲和层析 介质选择性吸附生物活性 物质.
（3）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
动画
7
二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
（1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
洗脱：
洗脱方法主要有三种：
非专一性洗脱
特殊洗脱
专一性洗脱
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非专一性洗脱
改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl－<I－<CF3COO－<SCN－ <CCl3COO－。
用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
55
特殊洗脱
4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。
pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
12
5、多孔玻璃珠：
化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质
有非特异性吸附，化学活性基团少。
有较大的亲和力。
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（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。
（五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
亲和纯化技术
亲和色谱
-间隔臂的作用
当配基分子量较小时，为 了排除空间位阻作用，需 要在配基和载体之间连接 一个“间隔臂”
间隔臂的长度有一定限制， 超过一定长度后，配基与 目标分子的亲和力会减弱
亲和色谱
-影响亲和吸附的因素
杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关
亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场 使介质与目标分子共同沉淀
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似，
多采用断通式前端分析
法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理
料液进料（feedstock loading）
组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。
亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；
物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
介质的活化方法－溴化氰法
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜
为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质， 是固定床亲和层析的变型。
亲பைடு நூலகம்膜-亲和膜的提出
固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）
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可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
与配基结合的层
析介质称为载体 （Matrix）。
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配基-底物（Ligand-substance）
配基-底物：亲和对
特异性好
通用性差
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Ligand
Substance 朱丽叶 杨贵妃 小龙女 祝英台 林黛玉 崔莺莺
梁山伯
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底物
酶 凝集素
Sepharose
CL,稳定性明显增加，能在pH3~14中应用。
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3、葡聚糖凝胶：
葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，
应用受到限制。
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4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的
亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
配基
受体，载体蛋白 抗原，病毒，细胞
谷胱甘肽 核酸
金属离子 抗体 激素，维生素
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聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp残基
互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋 白
谷胱甘肽-S-转移酶，GST融合蛋白 多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 底物类似物，抑制剂，辅助因子
二、载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
功能化，与配 基进行共价连 接
有较好的理化 稳定性和生物 惰性
具有高度的水 不溶性和亲水 性
具有多孔的立 体网状结构
应为大小均匀 的刚性小球
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（二）、常用载体
纤维素 (cellulose) 壳聚糖 (Chitosan) 琼脂糖凝胶
多孔玻璃珠
（Bio-Glass）
聚丙烯酰胺凝胶
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葡聚糖凝胶
1、纤维素
1、配基与配体有足够大的亲和力 ，KL 在10-4～10-8之间。
2、配基与配体的结合应是专一的
3、配基应具有化学活性
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（二）、配基的浓度
对亲和势比较低的系统（ KL≥10-4mol/L ），增加
配基浓度有利于吸附。
配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。
可以通过增加亲和柱的长度来提高吸附率。
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专一性洗脱
竞争性效应——正洗脱
非竞争性效应——不能达到洗脱目的
反竞争性效应——负洗脱
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专一性洗脱
S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）
竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱 剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。
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专一性洗脱
S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）
非竞争性效应，即ESI稳定性与EI相同，I的 存在不影响E对S的结合，用I不能达到洗脱 的目的。
多糖类载体
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
酰胺基
+
含氮化合物
→
胺衍生物
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五、 影响吸附亲和力的几个因素
影响亲和力的几个因素
空间障碍 （“手臂” 减轻空间障 碍）
配基浓度
配基与载体 的结合位点
载体孔径
微环境
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※六、 配基与间隔臂的连接
（一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。 非特异性吸附力较强，空间位阻。 主要用于分离与核酸有关的物质。
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2、琼脂糖凝胶
琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose
2B、4B和
6B（Pharmacia）。 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团， 结构疏松孔径大，流速快。
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四、 载体的活化与偶联
Q:载体在于配基偶联前为什么要
“活化”？
A：载体相对“惰性”，不能直接与配基连接（不容 易发生化学反应），因此在偶联前（载体与配基对接）， 需要对载体进行“活化”
活化的方式有很多种……
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载体的活化的方式
溴化氰活化法
高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
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（三）、配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结
合的部位与载体进行偶联。
例：
AMP-Sepharose亲和柱 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶 和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸 脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
选用大分子配基。
小分子物质作为配基，载体 和配基间插入一个“手臂” 以消除空间障碍。
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利用生物大分子物质 具有与某些相应的分 子专一性可逆结合的 特性而建立的层析技 术。
适用于从成份复杂且 杂质含量远大于目标 物的混合物中提纯目 标物。
7
经过一次处理可得到高 纯度活性物质 ；
特异性强、分离效果好、 分离条件温和；
亲和吸附剂通用性较差， 专用的吸附剂。
亲和吸附剂：载体—配基
在亲和层析中起
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思考题
某研究生在重组表达某一目的蛋白质分子T时，人为 地在编码蛋白质氨基酸序列的DNA终止序列前加了一 段核苷酸序列，如成功表达，获得的目的蛋白质分子 的C末端将有一段氨基酸序列，为：His-His-His-HisHis-His。 他这么做的目的是什么？ 如他要纯化该目的蛋白，需要使用什么样的材料？如 何纯化？
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5、多孔玻璃珠：
化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质
有非特异性吸附，化学活性基团少。
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6、其它载体——壳聚糖(Chitosan)
甲壳素和壳聚糖
壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物
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三 、 亲和配基
选择
偶联的位 置
浓度
分子的大 小
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（一）、配基的选择
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第一节 亲和层析 (Affinity Chromatography)
（1）配基固定化：配基与
载体偶联，结合成具有特 异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品：亲和层析 介质选择性吸附生物活性 物质. （3）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
6
一、亲和层析的原理和特点
第九章 亲和纯化技术
1
第九章 亲和纯化技术
亲和纯化技术（Affinity
“亲和力”
purification ）:利用
生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯 化的技术
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亲和纯化技术
亲和层析(Affinity 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取）
chromatography)
亲和沉淀（沉淀）
亲和电泳（电泳）
3
第一节 亲和层析
(Affinity Chromatography)
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亲和层析
一 、原理 二 、亲和层析载体 三 、亲和配基 四 、载体的活化与偶联 五 、影响吸附亲和力的因素 六 、配基与间隔臂的连接
七 、亲和层析的吸附和洗脱
提高选择性
对每一具体系统找出最佳的配 给浓度、pH、离子强度和温度。
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（二）、亲和层析的洗脱
非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱
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非专一性洗脱
改变洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度 离子强度的分步和梯度变化 降低缓冲液极性
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特殊洗脱
载体
配基
断裂方法有： 硫酯键用羟胺处理30分钟； 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理； 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。
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专一性洗脱
反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密。
增加了酶与配基的 结合力及亲和吸附 的选择性
将I除去——“负洗脱”
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反竞争性效应
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配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用
缓冲液充分平衡后即可重复使用。
非特异吸附增加 ，大多由变性蛋
亲和力下降，
白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。
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离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全结合，
将无关离子基团引入吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂会影
响蛋白质的洗脱行为。
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疏水基团
吸附剂疏水性基团 与蛋白质结构中的疏 水区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团：
（1）长的烃链结构的“手臂”：烃链 （2）疏水性配基
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复合亲和力
离子效应作用，又有疏水作用。 Nhomakorabea29七、 亲和层析的吸附和洗脱
吸附
洗脱
再生
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（一）、影响吸附的条件
1、亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 2、温度 升高会使吸附作用减弱。 3、流速 每小时低于10 ml/cm2。 4、上样体积 为柱床体积的5%。
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非专一 性吸附
离子效应
疏水基团 复合亲和力