氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略

反馈调节
1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2-柠檬酸合成酶 3-异柠檬酸脱氢酶 4-α-酮戊二酸脱氢酶 5-谷氨酸脱氢酶
• 黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制
优先合成与反馈调节

优先合成
谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会 抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节
• 代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代 谢物的双重控制。 • 一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机 制，酶的合成像普通蛋白质的合成一样，受到结构基因的 控制，由结构基因决定形成酶分子的一级结构； • 另一方面, 酶的生物合成还受代谢物（酶反应的底物、产物 及其类似物）的控制和调节。当有诱导物存在时，酶的生 成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶促反 应的产物，特别是终产物，又能产生阻遏作用，使酶的合 成量大大减少。
谷氨酸发酵的代谢途径


控制谷氨酸合成的重要措施
α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脱氢酶活力微
弱
谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。丧失α-酮戊二 酸脱氢酶的重要性已经用要求生物素和不分泌谷氨酸的大肠杆菌得以证明。甚至发现
不要求生物素的一株丧失α-酮戊二酸脱氢酶的突变株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其亲
反馈控制与优先合成
• 氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制（反馈阻遏与 反馈抑制）和在合成途径分支点处的优先合成 • 如图所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应A→B的初 始酶受终产物氨基酸E的反馈抑制和合成途径上各种酶受终 产物氨基酸E的反馈阻遏组成。
优先合成
• 底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶的酶 活性远远大于b酶的酶活性，结果优先合成E。E合成达到 一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G合成达 到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用
• 一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支 点酶（branching enzyme）可以成为关键酶，但关键酶并 不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基 酸生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程 中则不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在缬氨酸生物合成 途径中起主导性的关键酶作用，但在异亮氨酸的生物合成 中，起主导性关键作用的却是苏氨酸脱水酶。该酶位于α乙酰乳酸合成酶的前一阶段，并且不是分支点酶。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶， 受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏
优先合成与反馈调节

柠檬酸合成酶的调节
柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外， 还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制

异柠檬酸脱氢酶的调节
细胞内α-Baidu Nhomakorabea戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当α酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合 成α-酮戊二酸
CO2固定酶 系活力强
Citrate synthase, Aconitase, ICDH, GDH酶活力强 异柠檬酸裂解酶 活力欠缺或微弱
乙醛酸循环弱
α-酮戊二酸氧化 能力缺失或微弱
谷氨酸发酵的代谢途径

乙醛酸循环的作用
乙醛酸循环途径可看作
三羧酸循环的支路和中 间产物的补给途径
在菌体生长期之后，进
细胞膜对谷氨酸的通透性高
• 谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨 酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶 的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适 量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞 膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。 还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸，或青霉 素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏 感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控 制细胞膜对谷氨酸的通透性。
控制装置 控制装置的 动作 形成的控制 反应 代谢途径 细胞经济
DNA→mRNA→酶蛋白
终产物与阻遏蛋白的亲和力 阻遏蛋白与操纵基因结合， 不能合成mRNA 开、关控制 迟缓、粗的控制 无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等 高分子化合物(酶蛋白)
酶蛋白的构象变化
终产物与变构部位的亲和力 通过变构效应，酶的结构发生变化 控制酶活性大小 迅速、精确的控制 无定向代谢途径和合成代谢途径分支 点等 低分子化合物 (酶反应生成物)
谷氨酸生物合成的理想途径
• 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径
谷氨酸生物合成的理想途径
• C6H12O6 + NH3 + 3/2O2
C5H9O4N + CO2 + 3H2O
• 由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生 物合成谷氨酸的总反应方程式为： • C6H12O6 + NH3 + 1.5O2 C5H9O4N +CO2 +3H2O • 由于1摩尔葡萄糖可以生成1摩尔的谷氨酸，因此理 论糖酸转化率为81.7%。
协同反馈抑制或称多价反馈抑制
• 当一条代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不 能单独抑制途径第一个共同的酶促反应，但当两者同时过剩时， 它们协同抑制第一个酶反应
合作反馈抑制（Cooperative feedback inhibition）
• 合作反馈抑制也可称为增效反馈抑制（Synergistic feedback inhibition）。这种反馈抑制不同于协同反馈抑制，也不同于积 累反馈抑制 • 当任何一个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第一个酶的 活性，只有当G、E两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈 抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和
平衡合成（balanced synthesis）
• 底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶的酶 活性远远大于b酶，结果优先合成E。E过量后就会抑制a酶， 使代谢转向合成G。G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑 制作用，结果代谢流又转向合成E，如此循环
微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来 催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同，又可将酶分 为以下三类
Chapter2 L-谷氨酸
谷氨酸的生物合成途径
• 生成谷氨酸的主要酶反应
• 谷氨酸生物合成的理想途径
• 谷氨酸发酵的代谢途径
谷氨酸的生物合成包括
• 糖酵解作用（glycolysis, EMP途径） • 戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway，HMP途径） • 三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环） • 乙醛酸循环(glyoxylate cycle)
• 调节酶（常称关键酶，与代谢调节关系密切）
变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性的一类酶 同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子结构不同的一类酶 多功能酶：能够催化两种以上不同反应的一类酶
• 静态酶 • 潜在酶 一般与代谢调节关系不大的一类酶 指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶
同功酶
• 顺序反馈抑制的过程是：F积累，停止D→E反应，减少F的进一 步合成，更多的D转到G，再由G合成I或K；I积累，抑制G→H 的反应；K积累，抑制G→J的反应，结果造成G的积累，引起G 对A→B的反馈抑制，使整个途径停止
假反馈抑制(Pseudo-feedback inhibition)

假反馈抑制是指结构类似物引起的反馈抑制
优先合成与反馈调节

α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在谷氨酸产生菌中，α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱

谷氨酸脱氢酶的调节
谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏
谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑
制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。α-酮戊 二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的 活力很强，故优先合成谷氨酸
• 参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激 酶；②柠檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鸟氨酸转 氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高丝氨酸脱氢酶；⑦苏 氨酸脱水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脱氧 -D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸变位酶； 11预苯酸脱水酶；12预苯酸脱氢酶。
• 酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G过量时，酶Ⅱ停止活动， C也不能经过F到G • 与此同时，酶I活力不受影响，A可以顺利地到E，从而使G过量， 但并不干扰E的合成
反馈抑制与反馈阻遏的比较
项目 类型 控制对象 控制量 反馈阻遏 酶的生物合成 终产物浓度 反馈抑制 酶的活性 终产物浓度
控制的水平
入谷氨酸生成期，为了 大量生成、积累谷氨酸 ， 最好没有异柠檬酸裂解 酶催化反应，封闭乙醛 酸循环
谷氨酸生物合成的调节机制
• 优先合成与反馈调节
• 糖代谢的调节
• 氮代谢的调节
优先合成
α-酮戊二酸合成后由 于α-酮戊二酸脱氢酶 活性微弱，谷氨酸 脱氢酶的活力很强， 故优先合成谷氨酸。
• 黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制
• 丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）等
生成谷氨酸的主要酶反应
• 谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应 • 转氨酶（AT）催化的转氨反应
谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应
转氨酶（AT）催化的转氨反应
生成谷氨酸的主要酶反应
• 谷氨酸合成酶（GS）催化的反应
谷氨酸合成酶（GS）催化的反应
糖代谢的调节

能荷
细胞所处的能量状态用ATP、ADP和AMP之间的关系来表示，
称为能荷（energy charge）
能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于0.80
到0.95之间，处于一种动态平衡）
糖代谢的调节

能荷控制
如图所示，当生物体内即能荷降低， 就会激活某些催化糖类分解的酶或 解除ATP对这些酶的抑制（如糖元 磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸 合成酶、异柠檬酸脱氢酶等），并 抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、 果糖-1,6-二磷酸酯酶等），从而加 速糖酵解、TCA循环产生能量，通 过氧化磷酸化作用生成ATP。 当能荷高时，就会抑制糖元降解、 糖酵解和 TCA循环的关键酶，如糖 元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬 酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激 活糖类合成的酶，如糖元合成酶和 果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖 的分解，加速糖元的合成。
谷氨酸发酵的代谢途径
• 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
谷氨酸发酵的代谢途径
• 葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物 素充足时HMP所占比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占 的比例更大，HMP所占比例约为26%。 • 生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA， 另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙 酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 • 草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧 酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬 酸脱氢酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。 • α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸
株却什么也不分泌。谷氨酸产生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件 下，三羧酸循环到达α-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在α-酮戊二酸的堰 上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶
的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。

谷氨酸脱氢酶活性强

积累反馈抑制（Cumulative feedback inhibition）
• 在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共 同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所 以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的
顺序反馈抑制(Sequential feedback inhibition)
氨基酸代谢控制发酵机制 及育种策略
徐庆阳
中国氨基酸技术服务中心
目 录
• • • • • Chapter1 Chapter2 Chapter3 Chapter4 Chapter5 代谢机制理论基础 L-谷氨酸 L-亮氨酸 L-缬氨酸 L-异亮氨酸
Chapter1 代谢机制理论基础
氨基酸发酵机制
• 在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产 物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当 氨基酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止 该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微 生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中 这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶 的活性和酶量