第三篇第四章天冬氨酸族氨基酸发酵机制

§第七章天冬氨酸族氨基酸发酵机制
第一节天冬氨酸族氨基酸生物合成途径
及代谢调节机制
一、天冬氨酸族氨基酸生物合成途径
Glucose
EMP
丙酮酸
草酰乙酸
Asp
天冬氨酸激酶(AK)
天冬氨酰磷酸（asp-p）
天冬氨酸β-半醛
DDP合成酶（PS）高丝氨酸脱氢酶（HD）
二羟吡啶羧酸（DDP）高丝氨酸（Hos）
琥珀酰高丝氨酸合成酶高丝氨酸激酶
二氨基庚二酸（DAP）
琥珀酰高丝氨酸Thr
Lys 苏氨基酸脱氨酶
Met Ile
二、天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制
1、大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸生物合成的调节机制
Glucose
EMP
丙酮酸
草酰乙酸
Asp
(天冬氨酸激酶AK，同功酶)
天冬氨酸磷酸（asp-p）
天冬氨酸β-半醛
（同功酶）
二羟吡啶羧酸
高丝氨酸（Hos）
Lys
琥珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸
Met Thr
大肠杆菌天冬氨酸族氨基酸代谢特点：生物合成途径要比黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的代谢调控要复杂，其过程如下：
关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶
的活性才能完全被抑制。

同功酶：几种在同一细胞中催化同一反应的酶，但其活性受不同代谢产物体调节。

2、谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌天冬氨酸族氨基酸生物合成的调控
Glucose
EMP
丙酮酸
草酰乙酸
Asp
(天冬氨酸激酶，AK)
天冬氨酸磷酸（asp-p）
天冬氨酸β-半醛
二羟吡啶羧酸高丝氨酸
Lys
O-琥珀酰高丝氨酸 O-磷酸高氨酸
Met Thr
黄色短杆菌与大肠杆菌（E.coli）的区别：
（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制
（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制:P75
如图所示），即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：催化Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛 Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的合成上。

（Met＞Thr＞Lys）（3）代谢互锁：（metabolic interlock）P75
从生物合成途径来看，似乎是受一种完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是部分性的，不完全的。

在黄色短杆菌（乳糖发酵短杆菌）中，lys分支途径的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶（PS）受Leu的反馈阻遏。

（4）平衡合成：（balanced synthesis）
) E （Asp）
A B C
乙酰CoA)
(pyr)
底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶活性远大与b，结果优先合成E，E过量后抑制a酶使代谢转向合成G，G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果代谢流转向又合成E，如此循环。

在平衡合成机制中，由于第二个终产物的过剩逆转（拮抗）反馈控制，尽管存在着反馈控制机制，也能积累目的产物。

Asp生物合成途径与另一分支途径中间产物乙酰CoA的生成形成平衡合成。

当乙酰CoA过量合成时，能解除Asp对PEP羧化酶的反馈抑制。

（5）Asp与GA之间的调节机制：GA比Asp优先合成，当GA合成过量时，反馈抑制GHD（谷氨酸脱氢酶），使生物合成转向天冬氨酸，当Asp过量时，反馈抑制PEP羧化酶，使整个生物合成停止。

第二节赖氨酸生产菌的育种途径
一、行业简介
我国的Lys生产与国外的差距主要表现在：
（1）菌种性能的差异，国内菌种的产酸水平为：35—55g/L，转化率为：20—25%。

远低于国外的生产水平。

（2）提出率较低。

（3）生产规模较小。

二、赖氨酸的生物合成机制
细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型，第一节已述，以黄色短杆菌为例：
PC
Thr Met
TD
野生型 Lys高产菌
三、根据第一节所述代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，育种途径如下：
1、切断或减弱代谢支路
切断或减弱合成Met 、Thr的分支途径——选育营养缺陷型或渗漏突变株A、需要选用Hom L,其意义在于：
优先合成的转换： P77日本的椎尾
B、需要选用Hom-，其意义在于：
（1）解除了Hom的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。

（2）在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hom）
使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质上和Hom- 是一样的，但单个营养缺陷型标记菌株，有时会出现生产不稳定，易发生回复突变；双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。

例P78
2、解除反馈调节（—反馈阻抑）
PC AK PS
PEP Asp Asp ASA ASA Lys
1、Asp的反馈抑制
2、Lys+Thr的协同反馈抑制
3、受Leu的代谢互锁
A、AK反馈调节的解除：例 P78
尽管，从理论上讲，选育Hom- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用（课本，第73页，表6—1）。

因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom- 是不够的，但是为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题：
是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？可以选育结构类似物抗性突变株？（X r）
(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株 AEC r（效果最佳，应用最广）
(2)γ-甲基赖氨酸抗性突变株 ML r
（3）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHx r
（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHx r
选育组合型突变株：营养缺陷型+结构类似物抗性突变株
B、PC脱敏与激活（增加前体物和阻塞副产物）
1）Ala-或Ala温度敏感突变株（tem s）
2）选育AspHx r，解除 Lys对PC酶的反馈抑制。

固定和TCA循环酶活性比）：FP S（P81）
3）最佳的PDH/PC活性比（CO
2
4）用200-500μg/L的生物素激活PC：
一方面确保谷氨酸不排出体外，从而产生足够的反馈抑制，确保代谢流转向Lys的合成，另一方面，生物素能增加PC酶的活性，生成Lys，利于Lys的合成。

例：日本户坂修等人在培养基中添加200-500μg/L的生物素，培养乳糖发酵短杆菌明显提高Lys产量（42g/L）
5）GluHx s增大GA的反馈抑制，使代谢流转向草酰乙酸。

6）基因工程法构建柠檬酸合成酶活力低或丙酮酸激酶缺陷工程菌。

C、解除Leu代谢互锁
DDP合成酶受Leu阻遏，Ala,Val生成量显著增加。

1）Leu-：在培养基中限量添加Leu可以解除Leu对DDP合成酶的阻遏
2）选育抗Leu结构类似物突变株：（P80）
3）选育对苯醌或喹啉衍生物敏感突变株：实际是寻找Leu渗漏缺陷型菌株的方法3、改善细胞膜通透性
乳糖发酵短杆菌的Lys的排出是通过主动运输，培养液的浓度相当于细胞内浓度5倍，Lys仍能排出。

乳糖发酵短杆菌作为Lys生产菌株育种比大肠杆菌和酵母菌较优越。

在Lys育种中细胞工程，遗传工程和防止回复突变都很重要，见书P83-84。