母系遗传药物性耳聋与线粒体ND5T12338C突变的关系_褚雪莲
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·3688·
中国卫生检验杂志 2015 年 11 月第 25 卷第 21 期 Chin J Health Lab Tec，Nov． 2015，Vol． 25，No． 21
·分子诊断与基因检测·
母系遗传药物性耳聋与线粒体 ND5 T12338C 突变的关系
褚雪莲，黄灵，方苑仲
杭州市余杭区妇幼保健院检验科，浙江 杭州 311100
·3689·
及其他耳聋 相 关 的 影 响 因 素，详 细 地 询 问 了 耳 聋 患 者的病史并对其进行了系统体格检查。经筛查，发现 1 个携带线粒体 ND5 T12338C 突变的家系，该突变在 正常对照中不存在。该家系来自浙江省杭州市，家系 成员耳聋外显率较高。 1． 2 方法 1． 2． 1 体格检查和听力学检查 首先对该家系的先 证者及母系成员进行全面而系统的体格检查和听力 学检查。体格检查主要包括全身系统检查和综合征 型耳聋相关体征检查等。听力学检查包括纯音测听 （ pure tone audiometry，PTA） 、声阻抗、听觉脑干反应 （ auditory brainstem respons，ABＲ） 和畸变产物耳声反 射 （ distortion product otoacoustic emission，DPOAE ） 。 按照 WHO 耳聋分级标准，以听力水平的分贝（ dB） 数为单位进行听力损失检测，以语言频率（ 0． 5 kHz、 1 kHz、2 kHz） 的 平 均 听 阈 将 耳 聋 的 严 重 程 度 分 成 5 级： 正常为 ＜ 26 dB，轻度聋为 26 dB ～ 40 dB，中度 聋为 41 dB ～ 70 dB，重度聋为 71 dB ～ 90 dB，极重度 聋为 ＞ 90 dB。 1． 2． 2 基因组 DNA 提取 收集该家系所有成员的 外周血 2 ml ～ 4 ml，EDTA 抗凝。采用基因组 DNA 提 取试剂 盒 （ 批 号： SK8256 ） 提 取 外 周 血 标 本 基 因 组 DNA，经 1． 5% 琼脂糖凝胶电泳检测，－ 20 ℃ 保存备 用。 1． 2． 3 PCＲ 扩增线粒体基因组 使用 24 对互相有 部分片断覆盖的引物对先证者和母系成员的线粒体 基因组进行 PCＲ 扩增［3］，扩增产物纯化后通过 Big Dye 末端循环测序反应试剂盒在 ABI 3700 DNA 自动 测序仪上测序，测序结果使用 DNAman 软件与校正后 的人类 mtDNA 剑桥参考序列比对（ 基因登录号： NC_ 012920） ［4］，鉴定突变。 1． 2． 4 GJB2 基因突变筛查 使用 1 对引物扩增整 个编 码 区，引 物 的 序 列： 正 向 － 5' TATGACACTCCCCAGCACAG 3'，反向 － 5' GGGCAATGCTTAAACTGGC 3'。扩增产物进行纯化后测序并比对 GJB2 基因 的突变情况（ GenBank 登录号： M86849） ［5］。
作者简介： 褚雪莲（ 1977 － ） ，女，本科，主管技师，主要从事免疫学 检验方面的研究。
重要 意 义。此 外，线 粒 体 DNA （ mitochondrial DNA， mtDNA） 突变也是导致耳聋发生的重要原因之一，有 研究表明，线粒体 12S rＲNA 和 tＲNASer（ UCN） 基因是药 物性耳聋 的 突 变 热 点 区 域［1］，相 关 的 致 聋 突 变 包 括 A1555G、C1494T、A7445G、T7511C、7472insC 等［2］。 为了更好地研究是否存在其他和药物性耳聋相关的 mtDNA 突变，本研究在杭州市余杭地区开展了大规模 的耳聋线粒体基因突变的筛查。
病、视觉障碍、脑 疾 病 等 其 他 疾 病。 以 上 数 据 提 示 该 家系具有母性遗传的特点。 2． 2 线粒体基因组突变分析 为研究线粒体遗传背 景对耳聋表型的影响，对该家系的先证者和母系成员 进行了线粒体基因组的 PCＲ 扩增并测序，并未发现 A1555G、C1494T、A7445G、7472insC、T7510C 和 T7511C 等 已 报 道 的 致 聋 相 关 突 变。但 在 家 系 的 成 员 中发现 2 个同质性 tＲNASer（ UCN） C7492T 和 ND5 T12338C 突 变。共 发 现 了 31 个 多 态 性 位 点 （ 表 1） ，在 tＲNASer（ UCN） 上 有 1 个 变 异 位 点，在 蛋 白 编 码 区 共 有 20 个变异位点，其中 A8T8538C 变异导致异亮氨酸变 成苏氨酸，A6A8860G 变异导致苏氨酸变成丙氨酸， ND5 T12338C 突变导致蛋氨酸变成苏氨酸、G13708C 突变导致丙氨酸变成苏氨酸、G13928C 突变导致丝氨 酸变成苏氨酸，CytB C14766T 突变导致苏氨酸变成异 亮氨酸、A15326G 突变导致苏氨酸变成丙氨酸。与其 他物种（ 人、牛、小鼠和非洲爪蟾） 的 mtDNA 种系进化 分析后 发 现，在 这 些 多 态 性 的 位 点 中，除 了 ND5 T12338C 和 C7492T 突变外，其他变异在进化上均不 保守（ 表 1） 。
1 资料与方法
1． 1 资料 2010 年起本院共收集耳聋患者 204 例， 正常对照 98 例。根据余杭区妇幼保健院伦理委员会 相关规定的方法，参加此项目研究的耳聋患者及其家 系成员全 部 签 署 了 知 情 同 意 书。 同 时，为 了 明 确 是 否存在综合征型耳聋和氨基糖苷类抗生素使用史以
中国卫生检验杂志 2015 年 11 月第 25 卷第 21 期 Chin J Health Lab Tec，Nov． 2015，Vol． 25，No． 21
The association between maternally inherited hearing loss and mitochondrial ND5 T12338C mutation
CHU Xue － lian，HUANG Ling，FANG Yuan － zhong Clinical Laboratory，Yuhang Maternal and Children Health Care Hospital，Hangzhou，Zhejiang 311100，China Abstract： Objective To explore the molecular mechanism of aminoglycoside induced deafness，so as to provide direct evidence for clinical diagnosis and prevention of deafness． Methods We performed an molecular epidemiological investigation on hearing loss in Yuhang area． The audiological investigation and genetic analysis were performed on a family with maternal inheritable drug － induced deafness，moreover，the mitochondrial mutations and GJB2 gene mutations in the first patient and the maternal members were analyzed by direct PCＲ and sequenceed． The sequencing results were then compared with the NCBI standard nucleotide sequence，and the mutation sites were analyzed． Ｒesults This family exhibited a typical maternally inherited model with a high penetrance of hearing loss，while we failed to detect any mutations in GJB2 gene． 2 homogeneous tＲNASer（ UCN） C7492T and T12338C ND5 mutations were found in the members of the family． A total of 31 polymorphic sites were found， there was 1 mutation site in the tＲNASer（ UCN） ，there were 20 mutation sites in the protein encoding region． Conclusion Mitochondrial ND5 T12338C mutation may be associated with drug induced hearing loss，which is a mutation site causing hearing loss． And this will provide theological evidence for the early detection and treatment of deafness． Key Words： Deafness； Mitochondrial mutation； ND5 gene； T12338C
摘要： 目的 探讨药物性耳聋的发病机制，为临床早期诊断、预防提供理论依据。方法 在余杭区开展了耳聋的分子
流行病学调查。对 1 个母系遗传的药物性耳聋家系进行听力学检查和遗传学分析，对先证者和母系成员的线粒体基因
组和 GJB2 基因进行 PCＲ 扩增并测序，测序结果和 NCBI 上的标准序列进行比对，分析突变位点。结果 该家系呈现母 系遗传，耳聋外显率较高，但未筛查到 GJB2 基因突变。在家系的成员中发现 2 个同质性 tＲNASer（ UCN） C7492T 和 ND5 T12338C 突变。共发现了 31 个多态性位点，在 tＲNASer（ UCN） 上有 1 个变异位点，在蛋白编码区共有 20 个变异位点。结
2结果
2． 1 临床资料 该家系生活在浙江省杭州地区，先 证者（ Ⅰ － 2 ） ，女，33 岁，于 2014 年 12 月 来 本 院 体 检。经体格检查，家族史咨询后得知其怀孕期由于发 烧有过氨基糖苷类药物（ 庆大霉素） 接触史，但剂量不 明，用药后双耳听力呈对称性下降，听力学检查表明 为双侧重度耳聋，左 耳 83 dB，右 耳 88 dB。其 丈 夫 （ Ⅰ － 1） 听力正常，先证者于 2008 年和 2011 年先后 生下 2 个孩子（ Ⅱ － 1、Ⅱ － 2） ，听力学检查表明为双 侧中度耳聋，Ⅱ － 1 的左耳 55 dB，右耳 65 dB； Ⅱ － 2 的左耳 63 dB，右耳 68 dB。无噪声接触史和耳毒性药 物接触史，此外，经过体格检查，该家系成员中无糖尿
论 线粒体 ND5 T12338C 突变可能与药物性耳聋有关，是耳聋的一个致病性突变位点，这为耳聋的早期诊断与治疗提
供理论依据。
关键词： 耳聋； 线粒体突变； ND5 基因； T12338C
中图分类号： Ｒ764． 43
文献标识码： A
文章编号： 1004 － 8685（ 2015） 21 － 3688 － 03
Biblioteka Baidu
耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，严重影响 人们 的 身 心 健 康 和 生 活 质 量。 据 不 完 全 统 计，每 1 000名新生儿中就有 1 例 ～ 3 例听力障碍患儿，且迟 发性听力损失的发病率在人群中高达 10% 。耳聋是 由遗传因素和环境因素共同作用引起的，其中约 50% 的患者是由遗传缺陷造成的。遗传方式表现为常染 色体隐形遗传、常染色体显性遗传、X － 连锁遗传及母 系遗传等。世界各国学者对本国的耳聋患者进行大 规模的研究后发现，以常染色体隐性遗传最为常见， 占 75% ～ 80% ，其中编码连接蛋白 26（ Cx26） 的 GJB2 基因位于人染色体 13q11 － q12 上，编码区为 681 bp。 GJB2 基因突变在导致遗传性非综合征耳聋方面具有
中国卫生检验杂志 2015 年 11 月第 25 卷第 21 期 Chin J Health Lab Tec，Nov． 2015，Vol． 25，No． 21
·分子诊断与基因检测·
母系遗传药物性耳聋与线粒体 ND5 T12338C 突变的关系
褚雪莲，黄灵，方苑仲
杭州市余杭区妇幼保健院检验科，浙江 杭州 311100
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及其他耳聋 相 关 的 影 响 因 素，详 细 地 询 问 了 耳 聋 患 者的病史并对其进行了系统体格检查。经筛查，发现 1 个携带线粒体 ND5 T12338C 突变的家系，该突变在 正常对照中不存在。该家系来自浙江省杭州市，家系 成员耳聋外显率较高。 1． 2 方法 1． 2． 1 体格检查和听力学检查 首先对该家系的先 证者及母系成员进行全面而系统的体格检查和听力 学检查。体格检查主要包括全身系统检查和综合征 型耳聋相关体征检查等。听力学检查包括纯音测听 （ pure tone audiometry，PTA） 、声阻抗、听觉脑干反应 （ auditory brainstem respons，ABＲ） 和畸变产物耳声反 射 （ distortion product otoacoustic emission，DPOAE ） 。 按照 WHO 耳聋分级标准，以听力水平的分贝（ dB） 数为单位进行听力损失检测，以语言频率（ 0． 5 kHz、 1 kHz、2 kHz） 的 平 均 听 阈 将 耳 聋 的 严 重 程 度 分 成 5 级： 正常为 ＜ 26 dB，轻度聋为 26 dB ～ 40 dB，中度 聋为 41 dB ～ 70 dB，重度聋为 71 dB ～ 90 dB，极重度 聋为 ＞ 90 dB。 1． 2． 2 基因组 DNA 提取 收集该家系所有成员的 外周血 2 ml ～ 4 ml，EDTA 抗凝。采用基因组 DNA 提 取试剂 盒 （ 批 号： SK8256 ） 提 取 外 周 血 标 本 基 因 组 DNA，经 1． 5% 琼脂糖凝胶电泳检测，－ 20 ℃ 保存备 用。 1． 2． 3 PCＲ 扩增线粒体基因组 使用 24 对互相有 部分片断覆盖的引物对先证者和母系成员的线粒体 基因组进行 PCＲ 扩增［3］，扩增产物纯化后通过 Big Dye 末端循环测序反应试剂盒在 ABI 3700 DNA 自动 测序仪上测序，测序结果使用 DNAman 软件与校正后 的人类 mtDNA 剑桥参考序列比对（ 基因登录号： NC_ 012920） ［4］，鉴定突变。 1． 2． 4 GJB2 基因突变筛查 使用 1 对引物扩增整 个编 码 区，引 物 的 序 列： 正 向 － 5' TATGACACTCCCCAGCACAG 3'，反向 － 5' GGGCAATGCTTAAACTGGC 3'。扩增产物进行纯化后测序并比对 GJB2 基因 的突变情况（ GenBank 登录号： M86849） ［5］。
作者简介： 褚雪莲（ 1977 － ） ，女，本科，主管技师，主要从事免疫学 检验方面的研究。
重要 意 义。此 外，线 粒 体 DNA （ mitochondrial DNA， mtDNA） 突变也是导致耳聋发生的重要原因之一，有 研究表明，线粒体 12S rＲNA 和 tＲNASer（ UCN） 基因是药 物性耳聋 的 突 变 热 点 区 域［1］，相 关 的 致 聋 突 变 包 括 A1555G、C1494T、A7445G、T7511C、7472insC 等［2］。 为了更好地研究是否存在其他和药物性耳聋相关的 mtDNA 突变，本研究在杭州市余杭地区开展了大规模 的耳聋线粒体基因突变的筛查。
病、视觉障碍、脑 疾 病 等 其 他 疾 病。 以 上 数 据 提 示 该 家系具有母性遗传的特点。 2． 2 线粒体基因组突变分析 为研究线粒体遗传背 景对耳聋表型的影响，对该家系的先证者和母系成员 进行了线粒体基因组的 PCＲ 扩增并测序，并未发现 A1555G、C1494T、A7445G、7472insC、T7510C 和 T7511C 等 已 报 道 的 致 聋 相 关 突 变。但 在 家 系 的 成 员 中发现 2 个同质性 tＲNASer（ UCN） C7492T 和 ND5 T12338C 突 变。共 发 现 了 31 个 多 态 性 位 点 （ 表 1） ，在 tＲNASer（ UCN） 上 有 1 个 变 异 位 点，在 蛋 白 编 码 区 共 有 20 个变异位点，其中 A8T8538C 变异导致异亮氨酸变 成苏氨酸，A6A8860G 变异导致苏氨酸变成丙氨酸， ND5 T12338C 突变导致蛋氨酸变成苏氨酸、G13708C 突变导致丙氨酸变成苏氨酸、G13928C 突变导致丝氨 酸变成苏氨酸，CytB C14766T 突变导致苏氨酸变成异 亮氨酸、A15326G 突变导致苏氨酸变成丙氨酸。与其 他物种（ 人、牛、小鼠和非洲爪蟾） 的 mtDNA 种系进化 分析后 发 现，在 这 些 多 态 性 的 位 点 中，除 了 ND5 T12338C 和 C7492T 突变外，其他变异在进化上均不 保守（ 表 1） 。
1 资料与方法
1． 1 资料 2010 年起本院共收集耳聋患者 204 例， 正常对照 98 例。根据余杭区妇幼保健院伦理委员会 相关规定的方法，参加此项目研究的耳聋患者及其家 系成员全 部 签 署 了 知 情 同 意 书。 同 时，为 了 明 确 是 否存在综合征型耳聋和氨基糖苷类抗生素使用史以
中国卫生检验杂志 2015 年 11 月第 25 卷第 21 期 Chin J Health Lab Tec，Nov． 2015，Vol． 25，No． 21
The association between maternally inherited hearing loss and mitochondrial ND5 T12338C mutation
CHU Xue － lian，HUANG Ling，FANG Yuan － zhong Clinical Laboratory，Yuhang Maternal and Children Health Care Hospital，Hangzhou，Zhejiang 311100，China Abstract： Objective To explore the molecular mechanism of aminoglycoside induced deafness，so as to provide direct evidence for clinical diagnosis and prevention of deafness． Methods We performed an molecular epidemiological investigation on hearing loss in Yuhang area． The audiological investigation and genetic analysis were performed on a family with maternal inheritable drug － induced deafness，moreover，the mitochondrial mutations and GJB2 gene mutations in the first patient and the maternal members were analyzed by direct PCＲ and sequenceed． The sequencing results were then compared with the NCBI standard nucleotide sequence，and the mutation sites were analyzed． Ｒesults This family exhibited a typical maternally inherited model with a high penetrance of hearing loss，while we failed to detect any mutations in GJB2 gene． 2 homogeneous tＲNASer（ UCN） C7492T and T12338C ND5 mutations were found in the members of the family． A total of 31 polymorphic sites were found， there was 1 mutation site in the tＲNASer（ UCN） ，there were 20 mutation sites in the protein encoding region． Conclusion Mitochondrial ND5 T12338C mutation may be associated with drug induced hearing loss，which is a mutation site causing hearing loss． And this will provide theological evidence for the early detection and treatment of deafness． Key Words： Deafness； Mitochondrial mutation； ND5 gene； T12338C
摘要： 目的 探讨药物性耳聋的发病机制，为临床早期诊断、预防提供理论依据。方法 在余杭区开展了耳聋的分子
流行病学调查。对 1 个母系遗传的药物性耳聋家系进行听力学检查和遗传学分析，对先证者和母系成员的线粒体基因
组和 GJB2 基因进行 PCＲ 扩增并测序，测序结果和 NCBI 上的标准序列进行比对，分析突变位点。结果 该家系呈现母 系遗传，耳聋外显率较高，但未筛查到 GJB2 基因突变。在家系的成员中发现 2 个同质性 tＲNASer（ UCN） C7492T 和 ND5 T12338C 突变。共发现了 31 个多态性位点，在 tＲNASer（ UCN） 上有 1 个变异位点，在蛋白编码区共有 20 个变异位点。结
2结果
2． 1 临床资料 该家系生活在浙江省杭州地区，先 证者（ Ⅰ － 2 ） ，女，33 岁，于 2014 年 12 月 来 本 院 体 检。经体格检查，家族史咨询后得知其怀孕期由于发 烧有过氨基糖苷类药物（ 庆大霉素） 接触史，但剂量不 明，用药后双耳听力呈对称性下降，听力学检查表明 为双侧重度耳聋，左 耳 83 dB，右 耳 88 dB。其 丈 夫 （ Ⅰ － 1） 听力正常，先证者于 2008 年和 2011 年先后 生下 2 个孩子（ Ⅱ － 1、Ⅱ － 2） ，听力学检查表明为双 侧中度耳聋，Ⅱ － 1 的左耳 55 dB，右耳 65 dB； Ⅱ － 2 的左耳 63 dB，右耳 68 dB。无噪声接触史和耳毒性药 物接触史，此外，经过体格检查，该家系成员中无糖尿
论 线粒体 ND5 T12338C 突变可能与药物性耳聋有关，是耳聋的一个致病性突变位点，这为耳聋的早期诊断与治疗提
供理论依据。
关键词： 耳聋； 线粒体突变； ND5 基因； T12338C
中图分类号： Ｒ764． 43
文献标识码： A
文章编号： 1004 － 8685（ 2015） 21 － 3688 － 03
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耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，严重影响 人们 的 身 心 健 康 和 生 活 质 量。 据 不 完 全 统 计，每 1 000名新生儿中就有 1 例 ～ 3 例听力障碍患儿，且迟 发性听力损失的发病率在人群中高达 10% 。耳聋是 由遗传因素和环境因素共同作用引起的，其中约 50% 的患者是由遗传缺陷造成的。遗传方式表现为常染 色体隐形遗传、常染色体显性遗传、X － 连锁遗传及母 系遗传等。世界各国学者对本国的耳聋患者进行大 规模的研究后发现，以常染色体隐性遗传最为常见， 占 75% ～ 80% ，其中编码连接蛋白 26（ Cx26） 的 GJB2 基因位于人染色体 13q11 － q12 上，编码区为 681 bp。 GJB2 基因突变在导致遗传性非综合征耳聋方面具有