真核基因表达系统

4. 真核生物基因编码复杂
原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺 乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约 90%的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物 为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含 子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获 得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳 动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5’有帽状结构，3’末端有PolyA尾巴
2、组成元件：遗传标记
调控序列
1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定
营养标记基因：亮氨酸（Leu）
抗生素选择标记基因：Zeocin
2）调控序列
• ARS：酵母复制起始区(点)
• 酵母启动子：常用的有:
PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶)
• 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp)
细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可 自主复制，但稳定性差 • 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因 (YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制
酵母2μM质粒
1. 真核基因组巨大
大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
• 酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性
3、类型( types)
• 酵母克隆载体(yeast clone vector) ：不含酵母启动子，不能在酵母中
表达外源基因，如YIP、YRP、YEP
• 酵母表达载体(yeast expression vector)：酵母克隆载体+酵母启动子, 若引入信号肽序列，则成为分泌型载体
第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system
内 容
• 概述( introduction ) • 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation)
• 真核表达系统(eukaryotic gene expression system)
3. LiCl法：做成感受态细胞
四）外源基因在酵母菌中的表达
1、胞内表达：直接表达外源基因，
如：HBsAg的酵母重组疫苗
2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，
pGAPZ,利用因子分泌表达
五）高表达的策略
（1）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能 力强的GAP启动子
（2）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记， 以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变 发酵培养基的PH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可 避免产物被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。
Octamer
GGCCAATCT
ATTTGCAT
CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Oct-1 Oct-2 76,000 53,000 ~ 20bp ~ 23bp ~ 10bp 20bp
kB ATF
GGGACTTTCC GTGACGT
NFkB 44,000 AFT ?
增强子(enhancer) • 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件
• 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，
可以独立复制并转录。
（1）酵母克隆载体的构建
• 酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色 体，转化子稳定，但转化率极低。
真核启动子结构模式图
上游启动子元件
核心启动子元件
哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件
元件名称 TATA box GC box 共同序列 TATAAAA GGGCGG 结合的蛋白因子 分子量 结合DNA长度 ~ 10bp ~ 20bp
名称 TBP SP-1
30,000 105,000
CAAT box
Cis-acting factor
B gene
A gene
mRNA of A Protein A
mRNA of B Protein B
3、转录后的修饰
• 内含子的剪接
• 外显子的拼接 • mRNA的加尾和加帽
• mRNA的稳定性
4、翻译水平的调控
主要是microRNA对mRNA、tRNA 和rRNA的 调控
结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： • 起正性调节作用：启动子、增强子 • 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号
启动子
位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距 离作用、具有方向性、空间位臵较恒定。一般包括
• 核心启动子元件（core promoter elements) ：
（2）反式作用因子(trans-acting factor)
由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控
元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转
录活性。
P
Trans-acting factor
DNA
转录信号1
Trans-acting factor (DNA结合蛋白）
二、 原核表达系统的局限性
1、没有转录后的剪接和加工系统
2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基 化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白 的活性。
3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定
易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易 出现信号肽不被切割，或不在特异位臵上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低
1、转录前水平(基因组水平) ： gene level 2、转录水平调控: transcription level
3、转录后调控: posttranscription level
4、翻译水平的调控: translation level 5、翻译后修饰: post-translation modification
受体细胞
据受体细胞及表达载体的不同分为3种：
• 酵母表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统 • 昆虫细胞表达系统
一、酵母表达系统
• 发酵简单、快速、便宜
• 真核生物，有翻译后修饰功能
• 可分泌表达，简化了纯化工艺
• 受体细胞安全
（一）酵母载体:
1、概念：
携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增
和表达的载体，Βιβλιοθήκη Baidu括克隆载体和表达载体。
• 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性 • 无方向性（序列、位臵） • 远距离作用（1-4kB）
构建载体
• 无基因特异性
• 具组织特异性
沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式
与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾 信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成
3. 真核生物基因协调表达
细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同 开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是 单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。
真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚 基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生 物基因协调表达要比原核生物复杂得多。
1、转录前水平(基因组水平)： gene level
基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋 白修饰，DNA甲基化等
2. 转录水平调控
顺式调控元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
（1 ）顺式调控元件(cis-acting element)
二）受体细胞 1.啤酒酵母：
较早使用，了解清楚
安全性高，被FDA确认为安全生物
表达量较低
过量糖基化
转化子不稳定，易发生质粒丢失
2. 毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞
• 高表达（12g/L）
• 高稳定-----载体为整合型
• 高分泌（10g/L）
三）转化
1. 原生质体法：去除厚壁
2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切 线性化
指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的 精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的 TATA-box • 上游启动子元件（upstream promoter elements)
包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的 基础效率 • 组织特异性元件 • 诱导性启动子元件
酵母双杂交系统
Yeast Two-Hybrid System
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母 双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实 验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相 互作用对真核基因转录调控影响的实验。
酵母 复制 序列
（2）酵母表达载体
• 特点：含酵母启动子
穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外 源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细 胞中表达的载体。 • 种类：啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体：
分泌型表达载体
非分泌型表达
啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体------整合型
4、内毒素的污染 (contamination of endotoxin)
三、真核表达系统的必要性及优势
( advantages of eukaryotic expression system ) 1. 具转录后加工系统:
2. 具翻译后修饰系统
3. 可实现真正的分泌表达
第二节 真核基因表达调控特点
酵母表达系统(yeast expression system)
哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)
昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性
二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
一、真核基因组的复杂性
(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA
由下列元件组成 酵母染色体 2umDNA的复制起始区 着丝粒序列（CEN) 四膜虫端粒DNA(TEL)
• YAC: 利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列 （ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体 • 结构： 左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN 右臂：TEL、选择标记 • 特点：容量大（50-1000kb），稳定性差 • 作用：构建基因组文库
5、翻译后的调控
• • • • • •
切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解
第三节 真核表达系统
组成： 真核表达载体 受体细胞
真核表达载体
适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体根据受体不同，又可分为几种：
• 酵母表达载体
• 哺乳动物细胞表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
Features of Eukaryotic gene structure and expression
（一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面
（二）真核基因表达的调控模式
真核基因表达的调控模式
( The regulating model of eukaryotic gene expression)