流式细胞术的工作原理及其临床应用

流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术。它可测量细胞大小、内部颗粒的性状；可检测细胞表面和细胞浆抗原，细胞内DNA、RNA 含量等；可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，并能在短时间内检测分析大量细胞，以及收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集（分选）某一亚群细胞，分选纯度超过95%。随着各种相关技术的发展，流式细胞术已成为日益完善的分析细胞学和肿瘤标志学研究的重要工具。

1 流式细胞仪的结构及工作原理

流式细胞仪主要分为科研型（又称大型机、分析型）和临床型（又称小型机、台式机）两类，科研型的仪器功能齐全，分析灵活，但操作较繁琐，必须由经过培训的专业人员进行操作；临床型的仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室中应用。流式细胞仪主要由

以下五部分构成：① 流动室及液流驱动系统；② 激光光源及光束形成系统；③ 光学系统；④ 信号检测与存储、显示、分析系统；⑤ 细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射（FSC）光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。

流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满流动的鞘液；当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时，在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱经过激光聚焦区，与入射的激光束垂直相交，经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光；仪器中一系列光学系统，如透镜、光阑、滤片和检测器等，收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号；计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测

定的各种信号，对各种指标做出统计分析[1]。

科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中

流式细胞术的工作原理及其临床应用

Working Principle and Clinical Application of Flow Cytometry

[摘 要] 流式细胞术是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在医学临床及科学研究上发挥了非常重要的作用。本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在肿瘤学、血液学及免疫学等方面的临床应用进行了综述。

[关键词] 流式细胞术；工作原理；临床应用

Abstract : Flow cytometry is a new kind of technology which can analyze single cells by qualitative analysis and quantitative analysis quickly. With the development of analyzing techniques and methods, flow cytometry has being played an important role in the clinical medicine and scientific research. This paper introduced the working principle of flow cytometry synoptically and summarized its clinical application in oncology, hematology and immunology, etc.

Key words: flow cytometry; working principle; clinical application

[中图分类号] R459.5；R446.11+3 [文献标志码] B doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2011.03.033[文章编号] 1674-1633(2011)03-0091-03

吴晓娜，蒋红兵

南京医科大学附属南京第一医院 设备科，江苏 南京 210006

WU Xiao－na,JIANG Hong－bing Equipment Department,Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu 210006, China

收稿日期：2011-01-06 修回日期：2011-03-09作者邮箱：naiadsnowal@

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CLINICAL ENGINEERING

包有细胞，而细胞特质是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理，做更深入的研究。

2 流式细胞术的临床应用

2.1 在肿瘤学中的应用

流式细胞术在肿瘤学方面的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作[2]。恶性肿瘤的早期诊断是提高治愈和生存率的关键，良恶性肿瘤的鉴别诊断对于确定临床治疗方案具有决定性作用。迄今为止病理形态学诊断一直被视为肿瘤诊断的“金标准”，但由于某些肿瘤，特别在早期缺乏客观明确的诊断指标，不能提高诊断的正确率。

流式细胞术的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，特别是用流式细胞术分析细胞DNA含量，分辨率高、精确度好，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变，正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。然而临床上所谓癌前病变所包括的实际上是一大组生物学行为迥异的病变，其中一小部分具潜在癌变可能，而大部分完全是良性病变，因此要用病理形态学手段将其区别开来。只有那些不典型增生或称异型增生的上皮具癌变潜能，为了进一步区别不典型增生上皮癌变潜能的大小，通常根据其增生程度和形成表现将其分为I、II、III三级，分级越高，恶变可能性越大。DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。流式细胞术可精确定量DNA含量的改变，即检测出DNA非整倍体的出现，并将其作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，从而对癌前病变的性质及发展趋势做出评估，有助于癌变的早期诊断[3]。其具体方法是先将实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，再用荧光染料（碘化吡啶P1）染色后对细胞的DNA含量进行分析，最后将不易区分的群体细胞分成三个亚群（G0/G1期、S期、G2期），DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力证据[4]。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。

流式细胞术不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗

效，了解细胞动力学变化，在肿瘤化疗方面的意义尤为显著。临床工作人员可根据细胞周期各时相的分布情况，结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳治疗方案，再依照DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时调整治疗方案，选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果[5-8]。

2.2 在免疫学中的应用

机体免疫状态是机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是T、B和NK淋巴细胞的水平。T细胞主要包括Th 和Ts细胞亚群。CD3细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和。但我们检测患者T细胞及其亚群时，往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3的情况。这是因为CD4+细胞其实包括两部分：CD3+/CD4+细胞（真正的Th细胞）和CD3-/CD4+细胞（非Th细胞）；CD8细胞也包括两部分细胞：CD3+/CD8+细胞（真正Ts细胞）和CD3-/CD8+细胞（非Ts细胞）。而CD3-/ CD8+细胞又可以分为两组：一组为CD3-/CD8+/CD（16+56）+细胞（即NK细胞的一部分）；另一组为CD3-/CD8+/CD （16+56）-（一群未知细胞）。由此可见，真正的Th细胞是CD3+/CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+/CD8+细胞。若使用CD4或CD8单标单抗或CD4与CD8双标抗体来检测Th 和Ts，而不用CD3抗体进行限定，测出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞。因此，一定用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。

自然杀伤细胞（NK），又称裸细胞，因其表面没有类似T细胞和B细胞的表面标志。后来随着免疫力学的发展，发现了NK细胞的一些表面标志，如CD16、CD56等，但单用CD16和CD56的抗体无法正确鉴定出NK细胞，因此必须使用CD（16+56）抗体。这里还有一点必须引起足够重视，即NK细胞一定是CD3阴性表达细胞。所以CD3-/ CD（16+56）+细胞才是真正的NK细胞。

B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-/CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但实际检测中，CD3+/CD19+细胞很少，可以忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞[9-14]。

利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记（荧光探针），这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合。当细胞被激光器发射的激光照射后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发荧光，带荧光探针的单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号，这就

2011年第26卷 03期 V OL.26 No.03 92