重组乙型肝炎疫苗工艺中去除甲醛添加的探讨

2结果
2. 1 ＨＢｓＡｇ 经甲醛处理前后的磷钨酸负染色电镜 观察 磷钨酸负染色电镜观察结果显示，甲醛处理 能使 HBsAg 产生轻微聚合，见图 1。
甲醛处理前
甲醛处理 72 h
150813-02 批
50 nm
50 nm
150814-02 批
50 nm
50 nm
150915-01 批
50 nm
50 nm
Dalian Hissen Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Dalian 116600, Liaoning Province, China Corresponding author: SU Cai-xia, E-mail: sucx@hotmail.com
Abstract： Objective To evaluate the role of formaldehyde in processing of hepatitis B（HepB）vaccine by comparison of various indexes and stabilities of HBsAg and final product of recombinant HepB vaccine prepared with Hansenula polymorpha before and after treatment with formaldehyde, and provide a reference for elimination of formaldehyde addition in processing of the vaccine. Methods Various indexes of HBsAg and final product of recombinant HepB vaccine before and after treatment with formaldehyde were compared by scanning electron microscopy, HPLC, in vivo potency test as well as routine control tests, while the effects of formaldehyde on stability and validity period were evaluated by stability test. Results After treatment with formaldehyde, HBsAg was slightly aggregated, while the final product showed no significant change in ED50 or other indexes, and was qualified in abnormal toxicity test. However, the stabilities of final products before and after treatment with formaldehyde showed no significant difference. Conclusion The formaldehyde treatment in processing of recombinant HepB vaccine showed no effect on the quality indexes and stability of final product of vaccine, which might be eliminated to improved the quality and safety of vaccine. Key words： Recombinant hepatitis B surface antigen; Recombinant hepatitis B vaccine; Formaldehyde
表 1 3 批 HBsAg 甲醛处理前后的 HPLC Rt 值的比较（min）
Tab 1. Rt values in HPLC of three batches of HBsAg（min）
样品批号
甲醛处理前
甲醛处理 72 h
150813-02
6. 054
5. 999
150814-01
6. 053
6. 005
大连汉信生物制药有限公司，辽宁 大连 116600
摘要： 目的 通过比较甲醛处理前后重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和疫苗（汉逊酵母）成品各项检测指标及 稳定性的变化，评估甲醛在重组乙型肝炎疫苗工艺中的作用，为重组乙型肝炎疫苗工艺中是否可取消甲醛处理步 骤提供参考。方法 采用扫描电镜观察、HPLC 检测和疫苗体内效力评价指标半数有效剂量（ED50）、乙肝疫苗常规检 测项目比较甲醛处理前后 HBsAg 及疫苗成品的变化情况，通过稳定性考察确定甲醛对疫苗稳定性和有效期的影响。 结果 HBsAg 经甲醛处理后产生轻微聚合，但疫苗成品 ED50 和其他各项检测指标均无明显变化，动物异常毒性合 格。甲醛处理和未处理疫苗成品的稳定性考察结果相同。结论 重组乙型肝炎疫苗生产工艺中甲醛处理步骤对疫 苗成品检测指标及稳定性无影响，可考虑取消，从而提高乙肝疫苗的质量和安全性。 关键词： 重组乙型肝炎病毒表面抗原；重组乙型肝炎疫苗；甲醛 中图分类号： R373. 2 + 1 R392-33 文献标识码： A 文章编号：1004-5503（2017）08-0788-06 DOI:10.13200/j.cnki.cjb.001753
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中国生物制品学杂志 2017 年 8 月第 30 卷第 8 期 Chin J Biologicals August 2017，Vol. 30 No. 8
· 疫苗研究 ·
重组乙型肝炎疫苗工艺中去除甲醛添加的探讨
苏彩霞，李逦，韩旭东，金贞姬，赵平，王文雯，张平，李贵兴，鲁秀美，张海春，徐德启
中国生物制品学杂志 2017 年 8 月第 30 卷第 8 期 Chin J Biologicals August 2017，Vol. 30 No. 8
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1. 2 乙型肝炎病毒抗原及疫苗 重组乙型肝炎病 毒表面抗原（HBsAg）和重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵 母）成品由本公司生产，HBsAg 原液批号：15081302、150814-01、150915-01；3 批甲醛处理疫苗成品 批 号 ：201509001M、201509002M、201509003M，对 应 3 批甲醛未处理疫苗成品对照批号：201509001FM、 201509002FM、201509003FM。 1. 3 主要试剂及仪器 甲醛（分析纯）购自国药集团 化学试剂有限公司；四氯金酸（HAuCl4）（分析纯）购 自上海试剂一厂；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂 盒购自上海科华生物技术有限公司；高效液相色谱 仪（10Avp）为日本岛津公司产品；Tecan Sunrise 酶标 仪为瑞士 Tecan 公司产品；PHS-3C 型精密酸度计为 上海雷磁仪器厂产品。 1. 4 乙肝疫苗甲醛处理工艺流程 HBsAg 原液除 菌过滤后，按终浓度 100 μg ／ ml 加入甲醛溶液， 37 ℃处理 72 h，取样进行磷钨酸负染色电镜观察和 HPLC 分析。取甲醛溶液 37 ℃处理 72 h 的 HBsAg 原液，经原位吸附制成半成品，再将半成品分装得 到成品，按照《中国药典》三部（2015 版）中对重组 乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）的规定［ 6 ］对甲醛处理与 未处理的成品进行全项检定，包括半数有效剂量（ED50）、 相对效力（RP）、pH 值、吸附率、无菌、细菌内毒素、 铝含量、动物异常毒性等。 1. 5 ＨＢｓＡｇ 胶体金抗体的制备与电镜观察 1. 5. 1 胶体金的制备 采用柠檬酸三钠还原法。 用超纯水配制 0. 01%的 HAuCL4 溶液，取 100 ml 加 热至沸腾，迅速加入新配制的 1%柠檬酸三钠溶液 2. 5 ml，继续加热煮沸 7 ～ 10 min，直至溶液变成 葡萄酒红色［ 。 7-9］ 1. 5. 2 抗体的胶体金标记 先用 0. 1 mol ／ L K2CO3 或 0. 1 mol ／ L HCl 调整胶体金的 pH 为 9. 0，再在 电磁搅拌下向胶体金溶液中缓慢加入适量的抗乙肝 病毒表面抗原多克隆抗体（本实验室自制）。 1. 5. 3 胶体金免疫电镜 取 1 滴 HBV VLPs 抗原 滴加于铜网上，室温吸附 15 min；用 0. 1% PBS 洗涤 5 次，吸去余液，加 1 滴金标抗体于铜网上，37 ℃作 用 20 min；PBS 洗涤 5 次，吸去余液，用磷钨酸负染 5 min，干燥后电镜观察。 1. 6 疫苗成品的稳定性考察
通讯作者：苏彩霞，E-mail：sucx@hotmail.com
必要性，本实验对甲醛在重组乙型肝炎疫苗（汉逊 酵母）中的作用进行了研究，为重组乙型肝炎疫苗 工艺中是否可以取消甲醛处理步骤及发展更安全 的乙肝疫苗提供参考。
1 材料与方法
1. 1 实验动物 清洁级健康 BALB ／ c 小鼠，4 ～ 5 周龄，雌雄各半，体重 14 ～ 16 g，由辽宁长生生物技 术有限公司提供，批准号：SCXK（辽）2015-0001。
甲 醛（HCHO）在 医 院 和 实 验 室 中 常 用 作 消 毒 剂和防腐剂，已被世界卫生组织确定为致癌和致畸 物［ 1-2 ］。甲醛在大多数病毒和细菌灭活疫苗中作为 灭活剂［3-4］，血源乙肝疫苗工艺中也使用甲醛作为灭 活剂［5］；基因重组生物制品由于选择了安全的表达 系统，因此并不需要甲醛或其他灭活剂进行灭活，但 国内外大部分重组乙型肝炎疫苗（酵母、CHO 细胞） 工艺中使用甲醛处理抗原，可能是延续了血源乙肝 疫苗的工艺步骤。为了验证甲醛处理工艺是否具有
图 1 3 批 HBsAg 甲醛处理前后的电镜观察 Fig 1. Electron micrographs of three batches of HBsAg before and after treatment with formaldehyde
2. 2 ＨＢｓＡｇ 经甲醛处理前后的 ＨＰＬＣ 分析 HPLC 分析显示，甲醛处理后，3 批 HBsAg 的 HPLC 保留时 间（Rt）均变小，表明 HBsAg 有轻微的聚合，使 VLP 颗粒变大，Rt 值变小，见表 1 和图 2 ～ 4。
根据《中国药典》三部（2015 版）中对疫苗稳定 性评价的相关要求，制定本考察方案［10］。 1. 6. 1 初步稳定性考察 将 6 批疫苗成品于（37 ± 2） ℃放置，分别于 15、30、40、60 d 取样，60 d 后每 30 d 取样 1 次，检测体外相对效力，直至样品的体外
相对效力值低于 1. 0，即样品失效为止。每个时间 点检测的体外相对效力值与（6 ± 2） ℃放置样品的 体外相对效力检测值进行比较，分析变化趋势。 1. 6. 2 加速稳定性考察 将 6 批疫苗成品于（25 ± 2）℃放置，分别于第 1、2、3、6、9 个月取样，检测外 观、pH 值及体外相对效力，将每个时间点的检测源自文库 果与 0 月比较，分析变化趋势。 1. 6. 3 长期稳定性考察 将 6 批疫苗成品于（6 ± 2）℃放置，分别于第 3、6、9 个月取样，检测外观、pH 值 和体外相对效力，将每个时间点的检测结果与 0 月比 较，考察甲醛处理工艺对该疫苗质量和有效期的影响。
150915-01
Elimination of formaldehyde addition in processing of recombinant hepatitis B vaccine
SU Cai-xia, LI Li, HAN Xu-dong, JIN Zhen-ji, ZHAO Ping, WANG Wen-wen, ZHANG Ping, LI Gui-xing, LU Xiu-mei, ZHANG Hai-chun, XU De-qi