基因工程方法生产乙肝疫苗(详细参考)
基因工程方法生产乙肝疫苗(详细参考)
重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。
第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。
根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。
因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。
筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA 及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。
由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。
但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
基因工程乙肝疫苗
基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的使用
• 基因工程乙肝疫苗的接种对象、用法、贮存条件和有效期 等方面均同于血源乙肝疫苗，但其规格则不同于血源乙肝 疫苗。基因工程乙肝疫苗规格为5μg/0.5ml。 • 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）与血源乙肝疫苗可互换使 用。 • 临床研究表明，人体对基因工程乙肝疫苗（酵母重组）有 很好的耐受性，无严重副反应出现。有报道极少数对酵母 高敏者，在接种后有致敏现象，这种人群应禁用。
马铃薯乙肝疫苗人体试验成功
乙肝疫苗市场竞争现状分析
• 目前，全球约有20家企业被世界卫生组织 认定为疫苗生产商，然而疫苗市场实际上 被4家跨国企业所垄断，分别是原史克必成 公司（SKB）、巴斯德梅里公司 （Pasteur Merieux，PMSV）、默克公司 （MSD）和立达公司（Lederle）。这4家 公司掌握着全球约3／4的疫苗市场。
我国乙肝病情分布金字塔
肝癌 30~50万
肝硬化 （500万）
慢性重型肝炎（50~100万）
慢性迁延性肝炎阶段（1000万）
慢性迁延性肝炎阶段（2000万）
HBV携带者（〉10%，一亿几千万）
HBV 是一种小型DNA病毒，基因组由单个环形DNA分子构成； 球形颗粒，直径42nm； 包膜为脂质构成（含乙肝表面抗原 HBsAg），内为20面体核蛋白壳（含 乙肝核心抗原，HBcAg） 。
基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的生产工艺
• 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的生产工艺包括 发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序。 • 生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动 控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细 胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等 工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度 达99%以上。 • 所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减 少了种种人为因素的干扰，确保生产稳定和质量 一致性。
基因工程乙肝疫苗
基因工程乙肝疫苗(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--基因工程乙肝疫苗【摘要】基因工程乙型肝炎（乙肝）疫苗是人类同乙肝斗争的产物，是现代生物技术的重大成果。
它优质、安全、高效，可避免因乙肝导致的对人类健康的危害和巨大的经济损失。
基因工程乙肝疫苗（酵母重组）在我国乃至世界的乙肝计划免疫中日益发挥着重要作用，成为控制乙肝流行的主要疫苗【关键字】基因工程乙肝疫苗血缘乙肝疫苗一、乙肝疫苗病理目前使用的商售乙肝疫苗的一些明显的缺点是抗体应答较迟，一部分接种者不产生应答或应答较低。
一般情况下，有10%的成人不产生应答，另有5%～10%的接种者抗HBs水平低于100mIU/ml，HB疫苗低应答与许多因素相关，如年龄较大、吸烟、营养不良、肥胖、肾功能衰竭或免疫抑制者，特别是受主要组织相容性复合物（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）和T细胞受体等因素的影响，如何提高疫苗的应答水平是当今HB疫苗研究的热点。
有学者认为无应答和低应答者实际上是迟缓应答而已，通过增加剂量可能会促使抗体的产生，但尚待进一步研究验证。
由于现在使用的疫苗中未包含病毒变异株的基因，故有必要进行进一步的研究，在未来疫苗的配方中应尽可能包含这类病毒株，提高应答率。
二、基因工程乙肝疫苗取代血源乙肝疫苗已成定局：基因工程乙肝疫苗较之于血液乙肝疫苗主要区别之一在于它生产来源不同。
它有着许多血源乙肝疫苗不可比拟的优势。
自1985年以来，我国一直采用接种血源乙肝疫苗预防乙肝，血源乙肝疫苗对控制我国乙肝大面积流行曾起了很大作用，但是，由于血源乙肝疫苗需用乙肝病毒表面抗原携带者的血浆为原料，它具有一些自身无法克服的缺点：其一，乙肝表面抗原携带者由于已感染乙肝病毒，在此情况下，再抽取其血浆作为乙肝疫苗原料，对携带者的身体健康有损害；其二，疫苗的生产受到乙肝病毒表面抗原携带者血浆来源和质量限制，无法大规模稳定生产；其三，在表面抗原阳性血浆的采集、运输和加工过程中，存在着引发血源性传染病流行的可能性；其四，在血源乙肝疫苗的生产过程中，虽采用三步灭活工艺，但三步灭活不足以将血源中所有已知和未知的潜在致病因子全部灭活，难以最大限度地保证血源乙肝疫苗受种者绝对安全；三、基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的产量、生产工艺和质量控制1．基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的产量：高效稳定的大规模工业化生产是基因工程乙肝疫苗的一大优势。
基因工程乙肝疫苗ppt课件
答敏感性不同，所以有的人打疫
苗容易产生抗体，而部分人不会
产生抗体。乙肝疫苗第一针后大
概有30%左右的人产生抗体，而
第二针后有50%～70%左右，第
三针后90%左右产生抗体。
打乙肝疫苗前的注意事项有以下几点
•
•
1、有支气管哮喘和血清病的人、对青霉素等药物过敏者和过敏性荨麻疹
患者不能接种乙肝疫苗
•
2、成年人接种乙肝疫苗最好注射在上臂三角肌处，此处的接种成功率最
应用前景
• 基因工程乙肝疫苗较之于血液乙肝疫苗主要区别之一在于它生产来源 不同。它有着许多血源乙肝疫苗不可比拟的优势。
•
自1985年以来，我国一直采用接种血源乙肝疫苗预防乙肝，血源
乙肝疫苗对控制我国乙肝大面积流行曾起了很大作用，但是，由于血
源乙肝疫苗需用乙肝病毒表面抗原携带者的血浆为原、乙肝患者和乙肝病毒携带者不需要接种乙肝疫苗
•
4、非正常出生的婴儿(包括剖腹产)和出生后体质较差的婴儿最好推迟接种
时间
•
5、发烧患者和先天性免疫疾病患者或某些重症患者，应根据医院判断是
什么是基因工程乙肝疫苗？
• 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）是一种乙肝 表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它是采用 现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基 因进行质粒构建，克隆进入酵母菌中，通过 培养这种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚 单位。这种乙肝表面抗原亚单位具有原料易 得、产量大、安全、高效等特点。美国默克 公司研究的此产品最早获美国FDA批准。国 内生产此产品技术均从其引进。
应用学科
免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科 ）；免疫预防（三级学科）
• 发展概况
重组酵母乙肝疫苗首先在美国默克公司研 制成功，并于1986年被美国FDA批准通过。 1991年，我国自行研制的第一个基因工程 疫苗—哺乳动物细胞生产乙肝疫苗获准生 产。我国当前已能大规模生产乙型肝炎表 面抗原重组疫苗，分别称酵母重组和CHO（ 中国仓鼠卵巢细胞）重组疫苗，免疫效果 比同剂量的血源疫苗优良，并且十分安全 ，可以放心使用。
乙肝疫苗生物制品产品制备工艺流程
乙肝疫苗生物制品产品制备工艺流程英文回答：Production Process of Hepatitis B Vaccine Biologics.The production process of hepatitis B vaccine biologics involves several key steps to ensure the safety, efficacy, and quality of the final product.1. Cell Culture:Yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) are used to produce the hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is the main component of the vaccine.The yeast cells are genetically engineered to express the HBsAg protein.The cells are cultured in a bioreactor under controlled conditions to optimize HBsAg production.2. Purification:The culture broth containing HBsAg is harvested and purified through various steps, such as:Centrifugation to remove impurities.Ultrafiltration to concentrate the HBsAg.Chromatography to separate HBsAg from other proteins.3. Inactivation (for Inactivated Vaccines):For inactivated vaccines, the purified HBsAg is chemically inactivated using formaldehyde.Inactivation ensures that the virus is not capable of causing infection while retaining its immunogenic properties.4. Adjuvantion (Optional):Adjuvants can be added to enhance the immuneresponse to the vaccine.Common adjuvants used in hepatitis B vaccinesinclude aluminum hydroxide or AS04.5. Formulation:The purified HBsAg or inactivated HBsAg isformulated into the final vaccine product.Other components, such as preservatives, stabilizers, and buffers, are added to maintain the stability andefficacy of the vaccine.6. Filling and Packaging:The formulated vaccine is filled into sterile vials, prefilled syringes, or other appropriate containers.The containers are sealed and labeled with product information.7. Quality Control:Extensive quality control tests are performed throughout the production process to ensure that the vaccine meets the required standards of safety and potency.Tests include sterility testing, potency assays, and evaluation of physical and chemical properties.中文回答：乙肝疫苗生物制品生产工艺流程。
基因工程乙肝疫苗的制备
基因工程乙肝疫苗的制备【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。
本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程1.基因工程乙肝疫苗产生背景疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。
《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB ）计划免疫。
92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。
为了实现HB 计划目标，进一步为控制全球HB 做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB 疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg 阳性血浆。
血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。
因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。
利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg 生产HB 疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建2.1使用重组酵母的原因使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建HBV 只有3200bp ，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。
基因工程药物的研究现状——乙肝疫苗
三、什么是重组乙型肝炎疫苗 （CHO细胞）
• 采用基因工程技术将无传染性的乙 肝病毒表面抗原（HBsAg）的S基因 片段克隆到载体，用重组载体转染 真核生物CHO细胞通过细胞培养、 增殖、分泌出HBsAg到培养液中， 收集分泌液，经高速离心、纯化、 除菌后，加入佐剂吸附（氢氧化铝） 而制成。
四、重组CHO细胞乙型肝炎疫苗 的生产工艺
五、重组CHO细胞乙肝疫苗的优缺点
优点：CHO细胞表达的重组HepB是高等
真核细胞表达产物，其天然结构较低等 的真核细胞酵母表达的HBsAg蛋白更适 合人体吸收，生产工程中不同于酵母使 用硫氰酸盐处理，安全性好。 »缺点：产生一些副作用，例如 红肿、疼 痛、发痒、手臂酸重等症状，或者是产 生低热、乏力、恶心、食欲不振等与一 般疫苗相似的轻微反应。
六、现有疫苗的发展史及存在的问题
现有疫苗存在的问题
什么是成纤维细胞？
• 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。 分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口 愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 • 成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分， 细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动 状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细 胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清 楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合 成和分泌活动；纤维细胞功能活动不活跃，细胞轮廓不明 显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可 互相转化。 • 作用原理: 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸 和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α 多肽链 （proalpha polypeptide chain ），多肽链输送到高尔基 复合体后，组成前胶原分子。前胶原分子由分泌囊泡带到 细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽 酶催化下，将每一前α 多肽链的尾段除去，成为原胶原分 子。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横 纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。
基因工程乙肝疫苗的制备方法
基因工程乙肝疫苗的制备方法哇塞，说起基因工程乙肝疫苗的制备方法，这可真是个超级有趣又超级重要的事儿呢！你知道吗，基因工程乙肝疫苗就像是我们对抗乙肝这个“小怪兽”的超级武器。
那它是怎么被制造出来的呢？这可得好好讲讲。
首先呢，得有一些关键的“原材料”，就像做菜要有菜和调料一样。
这里面最重要的就是含有乙肝病毒表面抗原基因的质粒啦。
这就好比是制造武器的蓝图，有了它，才能开始后续的工作呀。
然后呢，把这个质粒放到合适的细胞里，让细胞像个小工厂一样开始生产乙肝病毒表面抗原。
这些细胞就会努力工作，不断地制造出我们需要的东西来。
这就好像是让一群勤劳的小蜜蜂开始酿蜜一样。
接下来，等细胞生产了足够多的抗原后，就得把它们收集起来啦。
这可不是一件容易的事儿哦，就像从一大桶蜂蜜里把纯净的蜜给分离出来一样。
收集好了抗原，还得进行一些处理和纯化，把杂质去掉，让我们得到的是纯净的、高质量的乙肝疫苗。
这就好比是把刚采下来的棉花加工成洁白柔软的棉花团。
再之后呢，要对疫苗进行严格的检测，确保它是安全有效的。
这可不能马虎呀，就像我们出门前要检查一下钥匙带没带一样重要。
最后，经过层层关卡的乙肝疫苗就可以被包装好，准备送到需要它的地方去啦。
你想想，这么复杂的过程，得有多少科学家和工作人员付出努力呀！他们就像是一群勇敢的战士，在为我们的健康而战斗呢。
基因工程乙肝疫苗的制备，真的是一项了不起的成就呢！它让我们有了对抗乙肝的有力武器，保护了无数人的健康。
难道这还不值得我们为它点赞吗？我们能生活在有这样先进技术的时代，真的是太幸运啦！所以呀，我们要好好珍惜这一切，也要感谢那些为了我们的健康而默默付出的人们。
希望未来还会有更多更好的疫苗出现，让我们的生活更加健康、美好！你说是不是呢？。
基因工程药物——乙肝疫苗
一、什么是基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防 和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白 质合成过程的基因取出来，经过一系列基 因操作，最后将该基因放入可以大量生产 的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、 酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细 胞，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模 生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质， 即基因疫苗或药物。 在医学和兽医学中应 用正逐步推广。
3、乙肝疫苗的药理作用、临床应用、不良反应
药理作用
临床应用
• • 目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种： （1）血源性乙肝疫苗：此疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成，故称血源性乙肝疫 苗。它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感 染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病 毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。为确保疫苗的 安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病 原体及血液中的抗原物质。此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决，但尚有一些缺点： ① 为防止可能存在的某些病原体在制备过程中逃避灭活，采用了严格、复杂且费时的物理与 化学方法纯化HBsAg抗原与灭活措施，使制备成本提高而疫苗产量不高；②随着乙肝疫苗长 HBsAg 期而广泛的使用，无症状HBsAg携带的数目势必逐渐 减少，最终将难以再用他们的血液制备 疫苗。 （2）基因工程疫苗：利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、 啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。目前多用酵母基因 的重组疫苗。其具有良好的免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严 重的不良反应。尽管它含酵母蛋白不超过1%，但对其产生变态反应的担忧尚未完全排除。 （3）含前S蛋白的乙肝疫苗：目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含 HBsAg蛋白，当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对 血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗， 它确能明显地增强免疫应答。
基因工程方法生产乙肝疫苗
基因工程方法生产乙肝疫苗乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。
[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝表面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。
[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。
国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。
[4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。
[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。
[5] 本文主要内容是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的流程。
乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。
乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。
S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。
小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。
在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。
由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。
[2]基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。
在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。
乙型肝炎病毒的基因工程与疫苗
分析； ａｎｕａ ９ Ｖｌｚｅ 等。也分析了Ｄ Ａ中Ｈ ｓｇ ｅ ｌ ， Ｎ Ｂ Ａ
基因，并且由核普酸顺序推测 出 ＨＢＡ Ｐ 的 ｓｇ Ｉ
从Ｈ ｓｇ ＢＡ 基因前后的转录起始编码Ｔ Ｔ ＡＡ
及终止信号 Ａ Ｔ Ａ的位置推测出的 ＨＢＡ Ａ Ａ Ｔ ｃｇ 基因转录产物含 １ ９ 个核昔酸。 ，７ ７
． ２６ ．
量 ２，０ 左右。从推算出的氨基酸顺序， ０ 。 ０ 可以
看到Ｃ 端的３ 个氨基酸中精氨酸占了一半左 ，
右，其次是脯氨酸和丝氨酸，与精蛋 白相 似。 Ｈ Ｖ Ｎ 可能与此相连。据分析 ， Ｂ Ｄ Ａ 这种结构 可能与 ＨＢ Ｖ致病机理有关。当核心抗原达一 定量后， 可能取代宿主染色体中的组蛋白等， 从 而引起宿主基因表达的紊乱。
白质编码区， 已肯定的是 Ｈ ｓｇ Ｈ ｃｇ基 Ｂ 和 ＢＡ Ａ
法国巴斯德研究所。 他们于 １７ 年底报告把 ９８ 因位置，二者相距 １ ０ 个核昔酸左右。 此外 ，０ ０ ａｗ 亚型的病毒 Ｄ Ａ克隆人大肠杆菌获得成 还有一个可能是 Ｄ Ａ聚合酶的编码区，按推 ｙ Ｎ Ｎ 功Ｅ。 ９ 很快在美、 ３ 英几个不同的实验室也都获得 算它含 ８２ ３ 个氨基酸残基［ 其他的编码意见 ８ ｌ 。 含乙型肝炎病毒Ｄ ＮＡ的大肠杆菌菌株［ １。 １ ７我 １ １ ０ － 尚不一致。在 Ｈ ｓｇ基因前，可能还存在含 ＢＡ 国和 日本也得到含 ａｒ ｄ 亚型病毒基因克隆。他 １３ ６ 个氨基酸编码的前 ＨＢＡ ｓｇ基因区（ｒ Ｓ， Ｐｅ ） 们都是把病毒 Ｄ Ａ 抽提出来， Ｄ Ｎ 在 ＮＡ聚合 意味着有 ＨＢＡ 前体存在。关于 ＰｅＳ ｓｇ ｒ 的作用 － 酶作用下把单链区补齐。 用限制性内切酶 Ｅｏ 是有争议的。 ｃ
乙肝病毒基因工程疫苗的研究及其应用
乙肝病毒基因工程疫苗的研究及其应用
一、引言
乙肝是一种病毒性肝炎，由乙型肝炎病毒（HBV）引起。
乙肝病毒基因工程疫苗是预防乙肝的一种有效措施，其基本原理是利用重组DNA技术制备的疫苗。
二、乙肝病毒基因工程疫苗的制备方法
1. HBV基因克隆：将乙肝病毒基因克隆到质粒中。
2. 质粒转染：将质粒转染到大肠杆菌中，得到大量的HBV基因重组质粒。
3. 重组蛋白表达：将HBV基因重组质粒转染到哺乳动物细胞中，使其表达重组病毒蛋白。
4. 病毒蛋白纯化：纯化重组病毒蛋白。
5. 疫苗制备：将病毒蛋白制备成疫苗。
三、乙肝病毒基因工程疫苗的应用
乙肝病毒基因工程疫苗已经被广泛应用于乙肝预防接种，其预防效果得到了充分肯定。
此外，乙肝病毒基因工程疫苗也有可能应用于治疗乙肝。
四、乙肝病毒基因工程疫苗的研究进展
随着科学技术的不断进步，乙肝病毒基因工程疫苗的研究也在
不断深入。
当前，主要的研究方向包括：1、疫苗的长效性和有效性；2、乙肝治疗性疫苗的研究；3、HBV表面抗原基因的变异与
疫苗免疫性的关系的研究。
五、乙肝病毒基因工程疫苗的局限性
当前，乙肝病毒基因工程疫苗的主要局限性包括：1、某些人
体免疫缺陷病毒性贫血患者无法有效接受疫苗；2、疫苗保护率低
于100%。
六、结论
乙肝病毒基因工程疫苗的制备方法简单、可重复性高、污染小、免疫原性强，已广泛应用于乙肝预防接种。
目前，乙肝病毒基因
工程疫苗的研究也在不断深入，未来将有望取得更加丰硕的成果。
乙肝疫苗
国外主要的乙肝疫苗生产厂家
厂家 美国默克公司 Merck 比利时史克公司 Smith kline 法国巴斯德研究所 Pasteur Merieux 德国莱茵公司下属的 韩国绿十字疫苗公司 Green Cross 疫苗 重组酿酒酵母乙肝疫 苗 重组酿酒酵母乙肝疫 苗 重组CHO细胞乙肝疫 苗 重组汉逊酵母乙肝疫 苗
• 北京天坛的 弱项和不足：表达水平低，
抗原数量少，每剂疫苗只含5微克或 10微克的抗原，比华兰疫苗抗原含量 少一倍，所以抗体滴度低和抗体持续 时间较短。
北京天坛和新乡华兰表达 水平和抗原产量的比较
表达水平
北京天坛 新乡华兰 50微克 300微克
抗原产量
低 高
北京天坛和新乡华兰疫苗 抗原含量和抗体反应的比较
每剂疫苗 抗原含量 抗体滴度 抗体持续时间
北京 天坛
华兰 公司
5微克（儿童） 低 10微克（成人）
10微克（儿童） 高 20微克（成人）
短
长
大连汉信和新乡华兰 纯化步骤和纯化收率的比较
纯化步骤
大连汉信 新乡华兰 多 少
纯化收率
低于20% 高于20%
汉逊酵母和啤酒酵母的比较
重组汉逊酵母的特点 （甲基营养型酵母）
的乙肝疫苗的基本情况： • 生产技术：从美国MERCK公司引进。 • 年产量：1000万人份，3000万支。 • 生产设备：从美国购进。
• 基本技术资料： • 菌种：重组酿酒酵母 • 表达水平：50mg/L • 表达效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵
母总蛋白） • 纯化收率：20% • 发酵罐工作体积：500L • 一次发酵所得抗原量： 50mg/Lх500L=25g • 纯化后所得抗原量25gх20%=5g • 可生产疫苗量 5,000,000/5=1,000,000支
乙肝疫苗的生产工艺
凝胶过滤柱层析 介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积 按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析
• 乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫 苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗 体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝 病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清 除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使 人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到 预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预 防乙肝病毒感染的最有效方法。
• 基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原 （HbsAg）亚单位疫苗，它系采用现代生 物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进 行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养 这种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表 面抗原亚单位。发酵后经过细胞破碎和一
⑤CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离
目的基因的表达
蛋白质的分离纯化
细胞破碎→固液分离→浓缩与初步纯化→高度纯化→成品加工
生产工艺控制
• 基因工程乙肝疫苗的生产工艺包括发酵、提取、 纯化、吸附、配制、分装等工序。
• 生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动 控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细 胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等 工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度 达99%以上
• 所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减 少了种种人为因素的干扰，确保生产稳定和质量 一致性。
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重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用
国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。
第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。
根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。
因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。
筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA 及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。
由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。
但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。
还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。
第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。
表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。
为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵
抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。
最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌
理化性质从热稳定性方面说
酵母源乙型肝炎疫苗37℃保存1周不改变其免疫原性
乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备，使用直接注射的方法打入静脉。
这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片段）：
,HBscFv等电点理论值为 8.5 1,实验值为 7.3～ 8.1（就是抗体）
综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。
对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。
目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种：
(1)血源性乙肝疫苗：此疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成，故称血源性乙肝疫苗。
它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。
为确保疫苗的安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病原体及血液中的抗原物质。
此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决。
(2)基因工程疫苗：利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。
目前多用酵母基因的重组疫苗。
其具有良好的免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严重的不良反应。
(3)含前S蛋白的乙肝疫苗：目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含HBsAg蛋白，当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗，它确能明显地增强免疫应答。
图1 乙肝病毒表面蛋白表达载体的构建
基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。
在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。
这可能是由于原核表达系统中不能进行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。
选用酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。
克隆载体构建时，将编码HBsAg的基因（野生型adw）添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的启动子之后。
如图1所示构建载体。
[6]将质粒转化至酵母菌中，通过HBsAg抗体与酵母菌积累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出成功转化的菌体。
对筛选出的菌体进一步发酵培养，摸索合适的基因工程菌培养条件，使产物尽量高效积累。