脂质体制备试验

实验十脂质体的制备及包封率的测定

一、实验目的

1．掌握薄膜分散法制备脂质体的工艺。

2．掌握用阳离子交换树脂法测定脂质体包封率的方法。

3．熟悉脂质体形成原理，作用特点。

4．了解“主动载药”与“被动载药”的概念。

二、实验指导

脂质体是由磷脂与（或不）与附加剂为骨架膜材制成的具有双分子层结构的封闭囊状体。常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团，将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外其他参数。

脂质体可分为三类：小单室（层）脂质体，粒径为20~50nm，经超声波处理的脂质体，绝大部分为小单室脂质体；多室（层）脂质体，粒径约为400~3500nm，显微镜下可观察到尤如洋葱断面或人手指纹的多层结构；大单室脂质体，粒径约为200~1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多为这一类。

脂质体的制法有多种，根据药物的性质或需要进行选择。（1）薄膜分散法：这是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。此法优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。（2）注入法：有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醚注入法”是将磷脂等膜材料溶于乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55~65℃含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1~2h，即可形成脂质体。（3）逆相蒸发法：系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如氯仿中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。（4）冷冻干燥法：适于在水中不稳定药物脂质体的制备。（5）熔融法：采用此法制备的

多相脂质体，其物理稳定性好，可加热灭菌。

在制备含药脂质体时，根据药物装载的机理不同，可分为“主动载药”与“被动载药”两大类。所谓“主动载药”，即通过内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。传统上，人们采用最多的方法是“被动载药”法。所谓“被动载药”，即首先将药物溶于水相或有机相(脂溶性药物) 中，然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体，其共同特点是：在装载过程中脂质体的内外水相或双分子层膜上的药物浓度基本一致，决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与磷脂膜材比)等。对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物，“被动载药”法较为适用。而对于两亲性药物，其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，包封条件的较小变化，就有可能使包封率有较大的变化。

评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布和包封率等。其中脂质体的包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。常见的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤法等。本文采用阳离子交换树脂法测定包封率。“阳离子交换树脂法”是利用离子交换作用，将荷正电的未包进脂质体中的药物（即游离药物），如本实验中的游离的小檗碱，被阳离子交换树脂吸附除去。而包封于脂质体中的药物（如小檗碱），由于脂质体荷负电荷，不能被阳离子交换树脂吸附，从而达到分离目的，用以测定包封率。

三、实验内容和操作

（一）空白脂质体的制备

1．处方

注射用豆磷脂 0.9g

胆固醇 0.3g

无水乙醇 1~2ml

磷酸盐缓冲液适量

制成30ml脂质体

2.操作

（1）磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）0.37g与磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)2.0g,加蒸馏水适量,溶解并稀释至1000ml(pPH约为5.7)。

（2）称取处方量磷脂、胆固醇于50ml小烧杯中，加无水乙醇1～2ml，置于65～70℃水浴中，搅拌使溶解，旋转该小烧杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球轻吹风，将乙醇挥去。

（3）另取磷酸盐缓冲液30ml于小烧杯中，同置于65～70℃水浴中，保温，待用。（4）取预热的磷酸盐缓冲液30ml，加至含有磷脂和胆固醇脂质膜的小烧杯中， 65～70℃水浴中搅拌水化10min。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温，搅拌30～60min，如果溶液体积减少，可补加水至30ml，混匀，即得。

（5）取样，在油镜下观察脂质体的形态，画出所见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体的粒径；随后将所得脂质体溶液通过0.8μm微孔滤膜两遍，进行整粒，再于油镜下观察脂质体的形态，画出所见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体的粒径。

3.操作注意

（1）在整个实验过程中禁止用火。

（2）磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，不能在水浴中放置过长时间。

（3）磷脂、胆固醇形成的薄膜应尽量薄。

(4) 60～65℃水浴中搅拌水化10min时，一定要充分保证所有脂质水化，不得存在脂质块。

（二）被动载药法制备盐酸小檗碱脂质体

1. 处方

注射用豆磷脂 0.6g

胆固醇 0.2g

无水乙醇 1～2ml

盐酸小檗碱溶液(1mg/ml) 30ml

制成30ml脂质体

2. 操作

（1）盐酸小檗碱溶液的配制：称取适量的盐酸小檗碱溶液，用磷酸盐缓冲液配成1mg/ml和3mg/ml的两种浓度的溶液。

（2）盐酸小檗碱脂质体的制备

按处方量称取豆磷脂、胆固醇置50ml的小烧杯中，加无水乙醇1～2ml，余下操作除将磷酸盐缓冲液换成盐酸小檗碱溶液外，同"空白脂质体制备" ，即为"被动载药" 法制备的小檗碱脂质体。

3．操作注意：同前。