紫外-可见分光光度法

§3. 紫外-可见分光光度计
主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光 源有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
2 单色器
单色器的主要组成：入射狭缝、出射 狭缝、色散元件和准直镜等部分。
2.1.2 按数字[1]键进入%T/ABS（透过率/吸 光度测定）子菜单，选中对应的数字键来 设定测定条件：①NUM WL(设定测试波长 的数目，最多可设定6个不同波长)；②WL Setting （设定测试波长具体数值）③ Data Mode( 选择测定吸光度或透光率 ) ，设定完 毕后点击 [Enter] 键确定，所有项目设定完 毕后按数字[0] 键确定，等待仪器调整至准 备状态。

2.1 Phtometry（定量运算） 2.1.1 按[MAIN MENU]键，再按数字[1]键 进入Phtometry子菜单下，选中对应的数字 来选择所需的测定方式：① %T/ABS （透 过率 / 吸光度测定模式）；② Ratio （比例 测定模式）；③ Concentration （浓度测定 模式ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ标准曲线模式）。
二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的 稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、 液层厚度乘积成正比，即 A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质 的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为 吸光物质浓度，l为透光液层厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
§4 分析条件的选择 适宜的吸光度范围
最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。
§5 测定方法 单组分是指样品溶液中含有一种组分， 或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与 其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法、标准对比法 和吸收系数法。
1 校准曲线法 方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲 线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方 程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度，从 标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样 的浓度。
1% E1cm
10 M
三、偏离朗伯-比耳定律的因素
（1）入射光为非单色光 （2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸 馏水中的微生物，存在散射以及共振发射 等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 （3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。
2.2 Wavelength Scan（波长扫描模式） 2.2.1按[MAIN MENU]键，再按数字[2]键 进入 Wavelength Scan （波长扫描模式） 子菜单下，选中对应的数字键来设定测 定条件：扫描的起止波长（开始波长为 大波长），测量模式，图谱坐标的上下 限，扫描速度等等。修改完毕按数字 [0] 键确定。
紫外-可见分光光度法的特点：
1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快; 2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度和准确度较高; 5 用途广泛。
§ 1. 紫外-可见吸收光谱
物质对光的选择性吸收
物质对光的吸收是选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础。
2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
As=Kcs
Ax=Kcx
cs Ax cx As
§6 操作规程
1. 开机 开机前将样品室内的干燥剂取出，确认 电源是否连接。打开仪器电源开关，等 待仪器自检通过，自检过程中禁止打开 样品室。
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible
spectrophotometry, UV-VIS)
它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性 分析、定量分析及结构分析, 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 按所吸收光的波长区域不同，分为紫外 分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外可见分光光度法。
1 I0 A lg lg ECL T I
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光 和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L· mol-1· cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
2.2.3 数据处理：按数字[1]键进入① Process（数据处理），可以读峰谷值， 修改坐标，显示所有数据，求一阶倒 数等等功能。
3 关机 将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水 冲洗比色皿至干净，用滤纸擦干；关电 源将干燥剂放入样品室内，盖上防尘罩， 做好使用登记，得到管理老师认可方可 离开。

此时屏幕上出现 AUTOZERO （校零）， 将盛有空白溶液的比色皿放入样品室中， 按[Start/Stop] 键进行零点的自动调整。自 动调零完成后（若测定吸光度，则仪器屏 幕右上角显示0.000; 若测定透光率，则显 示 100% 。若校正不理想则可按 [CLEAR RETURN] 键返回到 AUTOZERO 界面， 重新按[Start/Stop] 键再校一次零），打开 样品室盖，将样品置于光路中，关上样品 室盖，仪器自动测定当前样品溶液吸光度 或透光率，仪器的显示屏自动给出对应波 长的数值，待示值稳定后记录。
2.2.2 波长扫描：分别将两个比色皿装上空 白溶液和样品溶液，放入比色槽中，拉动 拉杆使光路孔对准空白溶液，按[Start/Stop] 键进行谱图扫描（如想终止扫描再次按 [Start/Stop]键），待仪器自动进行基线校正， 提示拉入样品自动测试，测试完毕后有扫 描图谱出现，下方有相应的数据处理选项 ① Process ②Baseline （重新进行基线校正） ③Print。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现 OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相 应选项前的数字键，即可进入该选项的 下一级子菜单。
4 要点与注意事项 4.1 开机前将样品室内的干燥剂取出， 仪器自检过程中禁止打开样品室盖。 4.2 比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为 宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。 测定时应保持比色皿清洁，池壁上液 滴应用滤纸擦干，切勿用手捏透光面。 测定紫外波长时，需选用石英比色皿。
4.3 测定时，禁止将试剂或液体物质放在 仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因 将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。 4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。 4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。
3 吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在 0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数字 显示装置等。
通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长 λmax进行物质含量的测定。
§2. 朗伯-比尔定律
一、吸光度和透光度 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It