《医学细胞生物学》课件：第四章 细胞生物学的研究技术
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第四章 细胞生物学的研究技术
Techniques in Cell Biology
Refer to knowledge
Preparatory observe put forward theoretics Design control tests
Collect data Explain results
• 视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。
• 能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微 镜高50倍。
普通显微镜
相差显微镜
DIC显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜 (Fluorescence Microscope)
• 照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品； • 光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；
Devise conclusion
第一节 细胞形态结构的观察
形态观察
光学显微镜 电子显微镜
普通光镜 特殊光镜
暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜
透射电镜 扫描电镜 高压电镜
扫描探针显微镜
扫描隧道显微镜 原子力显微镜
一、显微结构的观察
• 显微结构（microscopic structure）----通过光学 显微镜观察到的细胞结构。
• 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳，加强反 差和强度。然后用次氯酸 钠溶液消化样品，把碳和 铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。
• 复膜显示出了标本蚀刻面 的形态，在电镜下得到的 影像即代表标本中细胞断 裂面处的结构。
复膜
扫描隧道显微镜
(scanning tunneling microscope，STM )
• 用电子束作光源，用 电磁场作透镜，分辨 力可达0.2nm。
• 主要用于观察细胞内 部结构。
• 由于电子束的穿透力 很弱，用于电镜的标 本须制成厚度约4050nm的超薄切片。
扫描电镜
(scanning electron microscope，SEM ) • 电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子
• 不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的 可重复性大大提高。
第二节 细胞的分离与培养
• 有效获得单一类型的细胞 • 获得较大的细胞群体 • 细胞工程方面的应用
一、细胞的分离
• 利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。
• 从细胞悬液中分离某种细胞： 流式细胞仪
（flow cytometer, FCM） 亦称荧光激活细胞分选器 (fluorescence-activated cell
sorting, FACS)
二、细胞的体外培养
• 一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖， 而且可以表现出它在体内的一些分化特性。
• 有两个特殊的滤光 片，光源前的用以 滤除可见光，目镜 和物镜之间的用于 滤除紫外等，用以 保护人目。
荧光染料
抗体
特异性结合
抗原 (细胞的蛋白质成分)
分裂细胞的 免疫荧光图像
激光扫描共聚焦显微镜
(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)
• 用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描， 得到光学切片，并可整合为三维影像。
二、亚微结构的观察
• 亚微结构（submicroscpic structure）---- 细胞 中直径小于0.2um的结构。
• 超微结构（ultramicroscopic structure）---- 接 近分子水平的结构。
（一）电子显微镜 （二）扫描探针显微镜
透射电镜
(transmission electron microscope，TEM )
• Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上 发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率 差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的 硅藻（伪彩色）
暗视野显微镜
(dark field microscope)
• 聚光镜中央有挡光 片，照明光线不直 接进人物镜，只允 许被标本反射和衍 射的光线进入物镜。
（一）普通光学显微镜 （二）相差显微镜 （三）微分干涉差显微镜 （四）暗视野显微镜 （五）激光扫描共聚焦显微镜 （六）荧光显微镜
普通光学显微镜
目镜
物镜 载物台
集光器 光源
最大分辨率 0.2μm；最大放大倍数 1000倍。
H-E染色后的上皮柱状细胞
相差显微镜
(phase contrast microscope)
被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。
• 图像为立体形象， 反映了标本的表面 结构。
• 分辨力约为3nm。
高压电镜
(high voltage electron microscope)
• 加速电压大于120kV的透射电镜。 • 穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一
个完整细胞厚度。 • 可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细
• 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 • 分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达
0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。 • 利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如
DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些 生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
原子力显微镜
• 相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所 观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物 大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中 直接观察，故其适用范围有明显扩大。
倒置相差显微镜
相板
环状光阑
• 荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明：利用光的 衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变 成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对 活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。
微分干涉差差显微镜
(differential interference contrast (DIC) microscope)
胞骨架的立体网络。
电镜样品的制样技术
• 超薄切片技术 • 负染色技术 （染背景不染样品） • 冰冻蚀刻复型技术 • 扫描电镜样品制备技术
来自百度文库
冰冻蚀刻复型技术
• 标本置于-196˚C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本 断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露 出断面结构，称为蚀刻（etching）。
断裂
蚀刻
Techniques in Cell Biology
Refer to knowledge
Preparatory observe put forward theoretics Design control tests
Collect data Explain results
• 视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。
• 能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微 镜高50倍。
普通显微镜
相差显微镜
DIC显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜 (Fluorescence Microscope)
• 照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品； • 光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；
Devise conclusion
第一节 细胞形态结构的观察
形态观察
光学显微镜 电子显微镜
普通光镜 特殊光镜
暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜
透射电镜 扫描电镜 高压电镜
扫描探针显微镜
扫描隧道显微镜 原子力显微镜
一、显微结构的观察
• 显微结构（microscopic structure）----通过光学 显微镜观察到的细胞结构。
• 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳，加强反 差和强度。然后用次氯酸 钠溶液消化样品，把碳和 铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。
• 复膜显示出了标本蚀刻面 的形态，在电镜下得到的 影像即代表标本中细胞断 裂面处的结构。
复膜
扫描隧道显微镜
(scanning tunneling microscope，STM )
• 用电子束作光源，用 电磁场作透镜，分辨 力可达0.2nm。
• 主要用于观察细胞内 部结构。
• 由于电子束的穿透力 很弱，用于电镜的标 本须制成厚度约4050nm的超薄切片。
扫描电镜
(scanning electron microscope，SEM ) • 电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子
• 不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的 可重复性大大提高。
第二节 细胞的分离与培养
• 有效获得单一类型的细胞 • 获得较大的细胞群体 • 细胞工程方面的应用
一、细胞的分离
• 利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。
• 从细胞悬液中分离某种细胞： 流式细胞仪
（flow cytometer, FCM） 亦称荧光激活细胞分选器 (fluorescence-activated cell
sorting, FACS)
二、细胞的体外培养
• 一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖， 而且可以表现出它在体内的一些分化特性。
• 有两个特殊的滤光 片，光源前的用以 滤除可见光，目镜 和物镜之间的用于 滤除紫外等，用以 保护人目。
荧光染料
抗体
特异性结合
抗原 (细胞的蛋白质成分)
分裂细胞的 免疫荧光图像
激光扫描共聚焦显微镜
(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)
• 用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描， 得到光学切片，并可整合为三维影像。
二、亚微结构的观察
• 亚微结构（submicroscpic structure）---- 细胞 中直径小于0.2um的结构。
• 超微结构（ultramicroscopic structure）---- 接 近分子水平的结构。
（一）电子显微镜 （二）扫描探针显微镜
透射电镜
(transmission electron microscope，TEM )
• Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上 发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率 差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的 硅藻（伪彩色）
暗视野显微镜
(dark field microscope)
• 聚光镜中央有挡光 片，照明光线不直 接进人物镜，只允 许被标本反射和衍 射的光线进入物镜。
（一）普通光学显微镜 （二）相差显微镜 （三）微分干涉差显微镜 （四）暗视野显微镜 （五）激光扫描共聚焦显微镜 （六）荧光显微镜
普通光学显微镜
目镜
物镜 载物台
集光器 光源
最大分辨率 0.2μm；最大放大倍数 1000倍。
H-E染色后的上皮柱状细胞
相差显微镜
(phase contrast microscope)
被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。
• 图像为立体形象， 反映了标本的表面 结构。
• 分辨力约为3nm。
高压电镜
(high voltage electron microscope)
• 加速电压大于120kV的透射电镜。 • 穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一
个完整细胞厚度。 • 可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细
• 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 • 分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达
0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。 • 利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如
DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些 生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
原子力显微镜
• 相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所 观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物 大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中 直接观察，故其适用范围有明显扩大。
倒置相差显微镜
相板
环状光阑
• 荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明：利用光的 衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变 成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对 活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。
微分干涉差差显微镜
(differential interference contrast (DIC) microscope)
胞骨架的立体网络。
电镜样品的制样技术
• 超薄切片技术 • 负染色技术 （染背景不染样品） • 冰冻蚀刻复型技术 • 扫描电镜样品制备技术
来自百度文库
冰冻蚀刻复型技术
• 标本置于-196˚C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本 断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露 出断面结构，称为蚀刻（etching）。
断裂
蚀刻