生物催化剂的来源与筛选

图3-2 从自然界发现产酶微生物的方法
3．3．2 生物催化剂的高效筛选
• 高通量筛选（high-through screening, HTS）
是近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点是微量、快 速、灵敏、准确，在短时间内可以检测大量的微生物。
3．4 优良菌种选育
• 优良生产菌种应该具备的基本特点：
• 如何进行极端酶的研究和开发
①必须有足够的酶，这就涉及极端微生物的培养 ②依赖极端酶在中间宿主中的表达
表3-1 某些有应用前景的超级嗜高温酶
酶 葡萄糖异构酶 木聚糖酶 α-淀粉酶 纤维二糖水解酶 β-葡聚糖酶A， β-葡聚糖酶B β-甘露聚糖酶 α-半乳糖苷酶 β-葡萄糖苷酶 β-木糖苷酶 β-半乳糖苷酶 功 能 葡萄糖→果糖，生产高果糖糖浆 木浆和纸生产中水解木聚糖 淀粉水解 纤维素水解 纤维素水解 甘露聚糖水解 半乳甘露聚糖水解 纤维二糖水解 木二糖水解 乳糖水解 酶活力的最适温 度/℃ 95 105 85~90 105 95 92 100~105 105 未 定 80
• 诱变育种的基本方法
出发菌株的选择 诱变
诱变剂种类和剂量的选择 诱变剂使用方法的选择
诱变育种 营养缺陷型突变菌株筛选 抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株筛选 筛选 组成型突变菌株筛选 抗性突变菌株筛选
3．5 从环境中微生物基因组DNA筛选酶 的方法
• 从土壤和水样中提取DNA
土样 → 分离去除细菌→ 分离收集DNA片段→ 用限制酶剪 切DNA → PCR扩增→ 克隆到BAC载体内→ 转化培养微生物 （大肠杆菌） → 筛选转化株→ 功能基因→ 新酶
3．4．1 自然选育
• 自然选育（spontaneous mutation）：未经人
工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。
多因素低剂量的诱变效应
互变异构效应
•
复壮
3．4．2 诱变选育
• 诱变育种的原理
基因突变 突变 染色体畸变
表3-2 常用的各类诱变剂
物理诱变剂 化学诱变剂 紫外线、快中子、X射线、γ射线、激光、等离子束等 碱基类似物 2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8氮鸟嘌呤 硫酸二乙酯（DES）、甲基硫 酸乙酯、亚硝基乙基脲（EM S）、亚硝基甲基脲（NEU）、 亚硝酸（NA）、氮芥（NM）、 4-硝基喹啉（4-NQO）、乙烯 亚胺（EI）、羟胺 在DNA分子中插入或使之缺 失1个或几个碱基物质 生物诱变剂 噬菌体、转座子
3．3 微生物和酶的一般筛选方法
• 3．3．1从自然界发现产酶微生物
(1) 采样 (2) 富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量 较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件， 是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加， 由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。分为 分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方 式。 (3) 分离 (4) 筛选
第三章 生物催化剂的来源与筛选
大纲
• 3．1 概述 • 3．2 微生物酶筛选的策略 • 3．3 微生物和酶的一般筛选方法 • 3．4 优良菌种选育 • 3．5 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法
3．1 概 述
• 3．1．1 生物催化剂的概念 1 生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的 游离或固定化酶的总称。 2 分 类
百度文库
细胞 结构 酶 多细胞生物体 游离型催化剂 形式 固定化催化剂
3．1．2 生物催化剂来源与多样性
8% 4%
微生物 动物 植物
88%
3．1．3 生物催化剂的寻找和发现
• 提高筛选效率的基本原则 ①需要设计合适的用酶方法，使得目标反应非常清楚
②需要在有希望的微生物中寻找具有合适活性的微生物 ③需要建立方便和敏感的分析系统尽可能多的搜寻微生 物
3．2 微生物酶筛选的策略
• 3．2．1 常规生物催化剂筛选的一般策略
设计反应过程 选择合适的酶或产酶微生物 建立有效且方便的分析方法
生物催化剂筛选的反应过程的设计
图3-1 海因酶和N-氨基甲酰氨基酸水解酶两步选择性 水解制备D-对羟基苯基甘氨酸
生物催化剂筛选的反应过程的设计
• 例：①生物法：腈水合酶与酰胺酶催化反应生产丙烯酰胺 H2O CH2＝CH－CN 腈水合酶 • ②传统法：铜催化丙烯腈的水合生产丙烯酰胺
①生产菌种应该具备在较短的发酵周期内产生大量发酵物 ②在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的反应产物或副 产物，以便于分离纯化。 ③能利用多种来源的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小， 可用价廉易得的原材料进行培养，以降低发酵成本。 ④对需要添加的前体物质（底物）有耐受力，并且不将底物、产物作 为一般碳源利用。 ⑤具有抗杂菌污染，抗噬菌体感染的能力。 ⑥发酵泡沫少，利于提高装料系数、提高单罐产量、降低发酵成本 ⑦生长繁殖能力强，有较快的生长速率，遗传特性稳定。
3．2．3 未培养生物催化剂的发现策略
• 未培养微生物（uncultured microorganism）
美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出 “不能培养微生物（nonculturable microorganism）” 的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无 营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代 谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他 们用“活的但不能培养（viable but nonculturable, VBN C)”一语描述这种潜伏状态的细菌。
• 生物催化剂筛选的主要途径
（1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选
3．2．2 从极端微生物中筛选极端酶的策略
• 极端酶（extremozyme）
是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应 的中间型是常态微生物（mesophilic organism）产生的 酶。
• 土壤微生物DNA文库的构建
催化剂的回收制备 丙烯腈 除去O2 水 未反应的丙烯腈 丙烯酰胺产物 水合作用 催化剂的分离 浓缩 除去Cu离子，脱色
H2O CH2＝CH－CONH2 酰胺酶 CH2＝CH－COOH
酶或产酶微生物的筛选
• 一般产酶微生物筛选的原则
①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶； ②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； ③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性 ④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微 生物 ⑤微生物的遗传稳定性应该比较高