实验三、透明质酸酶的扩散作用

3.垂直放入37℃温箱，1小时后观察结果
结果：
阳性对照组出现凝固，阴性对照组不出现凝固，实验
组？
实验原理
致病性葡萄球菌产生的血浆凝固酶，在某 些辅助因子的存在下，使含有枸橼酸钠或 肝素等抗凝剂的兔或人血浆中纤维蛋白原 变成不溶性的纤维蛋白，使血浆凝固：非 致病性葡萄球菌不产生此种酶，因此血浆 凝固酶可以用来检测葡萄球菌有无致病性。
材料和仪器
• 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血平板培 养物 • 抗凝兔血浆、生理盐水、毛细滴管、接种 环、载玻片等
• 鲎（hòu），俗称三刺鲎、两公婆、海怪，因其长 相既像虾又像蟹，因此人们又称之为“马蹄蟹”,是 一类与三叶虫 (现在只有化石)一样古老的动物。与 它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有 鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相 貌，所以鲎有“活化石”之称。 • 雌雄一旦结为夫妻，便形影不离，经常见到肥大的 雌鲎常驮着瘦小的丈夫蹒跚而行。此时捉到一只鲎， 提起来便是一对，故鲎享“海底鸳鸯”之美称。
较弱,毒性效应大 致相同
甲醛处理不形成 类毒素
概
述
Hale Waihona Puke Baidu
• 内毒素主要生物学活性有：
致热作用；白细胞反应；感染性休克；
DIC 等。
• 需要用来检测内毒素的情况：
用来检测所配制的输液用品或生物制品中是
否含有内毒素； 临床上为了及时地确定患者是否有革兰氏阴 性菌感染（内毒素休克）引起的内毒素血症等。
• 检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎实验 法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高， 故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高， 可检测到10-4μg/ml的内毒素。
透明质酸酶的扩散作用、 血浆凝固酶实验、内毒素的检测 （鲎实验）
透明质酸酶的 扩散作用
实验原理
• 透明质酸是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖 聚合物，是一种黏蛋白多糖，有高度的黏 性，是结缔组织基质成分，在结缔组织细 胞间呈“细胞黏合剂作用”。乙型溶血性 链球菌等产生的透明质酸酶可水解透明质 酸，使结缔组织疏松，通透性增高，使细 菌和毒性物质易于扩散，故此酶亦称“扩 散因子”。
内毒素的检测 （鲎实验）
区别要点 来源 存在部分 化学成分 稳定性
外毒素 G+菌,及部分G-菌 活菌分泌,少数为菌体 崩解 蛋白质
内毒素 G-菌 为细胞壁成分,菌 体崩解 脂多糖
60-80 ℃,30min被破坏 160 ℃,2-4h被破 坏
毒性
抗原性
强,有选择性,引起特殊 表现 强,可刺激机体产生抗 毒素,可被制成类毒素
材料
• • • • 家兔 溶血性链球菌24h肉汤培养物滤液 墨汁，生理盐水，70%酒精，无菌棉签等 无菌注射器、小试管、手术剪、镊子
方法和结果
• 方法 1，取家兔一只，剪去背两侧的部分兔毛，用70%的酒精消毒。 2，分别吸取墨汁和溶血性链球菌培养物滤液的混合液0.1ml和墨 汁与生理盐水混合液0.1ml。 3，在家兔背两侧分别将刚才的两种各0.1ml的混合液皮内注射 （5º -10º ，斜面进入，小皮丘。注射时注意：不可使黑色液体 漏出）。注射后用标记笔画出黑色的范围，并测量其半径，1h 后再测量一次黑色的范围的半径。 • 结果： 对比两种混合液扩散的差别，并分析其原因。
• 鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色 的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”， 可以准确、快速地检测人体内部组织是否 因细菌感染而致病；在制药和食品工业中， 可用它对毒素污染进行监测。
原
理
鲎（hòu）是一种海洋节肢动物，其 血液中含有一种有核变形细胞，这种细 胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。
方法和结果
• 方法 1，取洁净载玻片一张，于两端各加一滴生理盐 水 2，用灭菌接种环子血琼脂平板上挑取两种葡萄 球菌培养物少许，分别混悬于载玻片的两端的生 理盐水中，使其成为均匀的细菌悬液，观察有无 自凝现象，然后在每滴细菌悬液中各加入抗凝的 兔血浆一滴，混匀。 • 结果 数秒钟后观察结果，细菌呈颗粒状凝集为阳性， 无凝集则为阴性。
血浆凝固酶实验
（玻片法）
概述
• 葡萄球菌按照有无凝固酶可分为凝固酶阳 性菌株和凝固酶阴性菌株，在多数情况下 凝固酶阳性葡萄球菌为致病性菌株，而凝 固酶阴性葡萄球菌为非致病性菌株。 • 凝固酶作为葡萄球菌的一种毒力因子，其 作用是: 1,阻碍体内吞噬细胞的吞噬; 2,保护 细菌不受血清中杀菌物质的破坏；3,与葡萄 球菌引起的感染易于局限化和形成血栓有 关。
凝固酶原
内毒素（LPS） 激活
凝固酶
凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解状态） （凝胶状态） BACK
材
• 鲎试剂 • 鲎试剂溶解水 • 无菌吸管
料
方法及结果
方法：
1.取三支鲎试剂打开，分别加入0.1ml 鲎试剂溶解水，
使之溶解 2.其中一支加入0.1ml大肠杆菌内毒素，标记上阳性组， 另一支加入0.1ml溶解水，作为阴性对照组，第三支加 入0.1ml待测样品。