高通量测序问题

第二代高通量测序常见问题

1. 你们做不做第二代高通量测序？

Answer：我们是国内最早从事第二代高通量测序的单位之一，2007 年初就引入了454 测序系统，至2011 年底已经运行了300 多个完整反应，是目前国内运行量最大的454 测序平台。而2010 年引入Solexa 测序系统后，已经先后完成过包括人的肿瘤基因组测序，外显子捕获测序，RNAseq，小RNA 测序，大型真核生物基因组测序等不同的任务，基本处于饱和运转的状态。

2. 我想做第二代测序，你们是怎么收费的？

Answer：所有测序都是根据客户要做哪类测序（基因组、转录组还是分子生态等），选择哪种测序系统，测序的量，以及对分析的要求来确定收费标准的；所以需要客户先说明他想做的内容。微生物基因组部分：

3. 我有个细菌想测序，你们怎么收费?

Answer：细菌基因组测序，分为草图和完成图两种类型。

（1）草图：就是测序后直接拼装，得到的彼此没有关系的contigs 就称为基因组草图；如果做基因组草图，可以选择Solexa 或者454：用solexa 测序的话，一般我们是做100 倍覆盖率的pair-end 测序，通常是建300bp 插入片段的文库；用454 测序的话，就是做20 倍覆盖率的shotgun 文库。通常solexa 价格便宜，但得到的contigs 数目也多，并且拼装不够准确，不能用来构建完成图。而454测序拼装的结果非常准确，contigs 数目也少，一般会在100 个左右（只是统计值，不能向客户保证），而且能够在这个基础上做完成图。

（2）完成图：就是把所有的contigs 接起来，一般是通过PCR 等方法确定contigs之间的关系，并通过对PCR 产物进行常规测序，填补所有gap，最终得到一条完整的环状基因组序列（链霉菌是线性染色体，有些细菌是多条染色体）。在填补完所有gap 后，我们还会对测序中的低值区域进行补测，最后得到的序列精确度在99.99%以上，即错误率低于万分之一（1bp/10kb）。我们是目前国内做细菌完成图最多的单位，已经完成了近80 株细菌的完成图，合作单位发表的SCI 文章已有20 余篇。

(3)精细图：这是对真核基因组测序来说的，严格来说细菌不应该存在精细图这个概念，即使存在1 个gap，也应该称为草图。但由于市场上很多公司做gapclosing 做到最后有些gap 关不掉，就提出了这么一个概念。如果客户提出做精细图，想要向他讲明我们一般就是做草图和完成图，然后他如果需要精细图，我们就会在草图的基础上，加测一个solexa 的3kb 插入片段mate-pair，构建一个scaffold，即客户要求的精细图。价格根据客户需要做哪种测序来确定。

4. 你们细菌基因组测序，包括哪些分析？

Answer：我们一般测序完成后，无论草图还是完成图，都会帮助客户做基因预测，功能注释，COG 分析和代谢通路构建这几项基本分析。但如果客户需要更深入的比较基因组学分析，就需要收费。对于细菌基因组来说，所有的分析工作我们都可以完成，但除非是有科研合作的单位，否则我们不参与客户的文章写作。

5. 你们做不做真菌基因组测序？

Answer：我们至今已完成30 余株真菌的基因组测序工作。由于真菌一般是多条线性染色体，存在着丝粒和端粒等极难克隆和测序的区域，所以通常对真菌基因组都是以获得精细图为主。我们的做法有两种：

（1）以454 做20 倍覆盖率的shotgun 测序（一般先估计真菌的基因组大小为40Mb），拼装获得contigs；然后在此基础上，加测一个100 倍覆盖率的solexamate-pair 测序（3kb 插入片段），用以搭建scaffold。最终给客户的结果就是这个scaffolds，即精细图。

（2）以solexa 做100 倍覆盖率的pair-end 测序（一般建2 个不同插入片段的文库，我们通常做170bp 和500bp 两种），拼装获得contigs；然后再加测一个100 倍覆盖率的solexa mate-pair 测序（3kb 插入片段），用以搭建scaffold。最终给客户的结果就是这个scaffolds，即精细图。

（3）以454 为基础的精细图效果要好于以solexa 为基础的精细图，通常454拼装的contigs 数目在1000 个左右，scaffold 在50 个左右；而solexa 的结果就很难估计。

6. 做基因组草图或者精细图，你们能保证的contigs 或scaffold 数目是多少？

Answer：基因组测序拼装，受多个因素影响，包括基因组大小，覆盖率，重复序列等，其中重复序列影响最大，所以同样大小的基因组，拼装结果都会差异很大。因此除完成图外，通常我们不向客户承诺拼装的contigs 数目，只能告诉客户，一般细菌拼出来的contigs 数目在100 个左右（链霉菌会更高一些）真菌用454；测序，拼出来的contigs 在1000 个左右。

7. 高GC 含量的细菌如何做？

Answer：目前我们做的最多的细菌类群就是放线菌，包括链霉菌，结核分枝杆菌等，都是高GC 的。在早期我们向Roche 公司提出454 对高GC 的DNA 测序效果不好后，它们专门开发了additive，目前这个试剂已经添加在所有的454 测序试剂中，因此对于高GC 含量的细菌测系效果特别好。如果客户做链霉菌测序，尽量选用454 测序。如果是做结核分枝杆菌这种高度保守的细菌的重测序，可以考虑用solexa，但要告诉客户，像PE/PPE/PE-PGRS 等高GC 的区域是测不到的，或者说即使测到了也mapping 不上去。

8. 测序的完成时间,样本要求：

Answer：做细菌的草图都是2 个月以内，但454 基本可以在1 个月左右出来结果（建库和上机只要3 天，主要是要排队），solexa 由于在机器上就要10 多天，所以一般都要2 个月左右才能得到数据。对于细菌的完成图，我们的平均时间是6 个月；但像链霉菌等高GC 的菌，时间平均要9 个月。一般我们向客户承诺的时间都是8－12 个月。这个工作我们可以保证质量，但毕竟是实验的东西，无法保证时间。对于测序的样本，我们要求客户提供抽提好的DNA，浓度最好在50ng/ul左右，总量要达到5ug（通过凝胶电泳定量）。如果要做完成图，需要提供20ug以上的DNA。对DNA 要求是没有明显降解，OD260/280>1.8。

转录组测序部分：

9. 我要做RNA 测序或者转录组测序，如何做？

Answer：首先要明确客户的目的，是为了发现新基因，还是做表达谱分析（用测序代替芯片）；再就是要询问客户要做的物种有没有已知的基因组序列。

（1）转录组测序：如果是全新的物种，还没有基因组，那么最好是用454 做转录组测序，即获得EST 序列，然后我们会对EST 序列进行拼装和注释，得到这个物种的转录本信息。如果客户不想做时期/组织间的比较，只是为了获得尽量多的基因信息，那么就推荐客户把几个不同处理/时期的样本混合在一起，做一份转录组测序。如果客户还想做丰度比较，就需要把几个样本分开，我们分别建库和测序。

（2）RNAseq：如果客户要做表达谱分析，基本就可以用solexa 做RNAseq，但前提是他的物种有已知的基因信息；否则我们得到的数据只能与近源物种做比对，匹配效率会低很多。一般RNAseq，每个样品测序得到500 万条序列，就可以达到饱和，代表这个样品的多数表达基因。因为目前我们solexa 测序都是做pair-end，所以承诺客户500 万条序列，我们实际是测500 万对（1Gb 的数据量）。

10. 用454 做转录组测序，我需要做多少测序量？平均长度是多少？可以保证拼出多少unigene？

Answer：一般来说，一个物种做一个完整反应的454 测序，可以获得80 万条以上的有效序列；通过拼装可以获得约2－3 万个EST cluster。但这些EST cluster有些是属于同一个基因的，只是中间没有测到或可变剪接的原因，导致无法拼到一起。对于新的物种。这样的情况我们是无法确定哪些EST cluster 是属于同一个基因的。因此，我们无法保证客户获得的unigene 数目，只能承诺测序得到的数据量。转录组测序序列平均长度要比基因组测序短，因为很多RNA 本身就很短，所以一般转录组测序我们承诺的平均长度要比基因组短100bp。目前我们是承诺客户平均长度为300bp；等到升级后我们可以承诺500bp。对于发现新基因来说，一般一个完整反应拼装得到的EST cluster 可以代表多数基因；但对于低丰度的基因还是难以发现，因此多数客户会选择做1－2 个run 的454 反应。

11. 转录组测序的分析内容：