现代分子生物学课件-第六章上课讲义
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锚 定 酶 （ 设 为 Nla)酶 切 ， 磁 珠 吸 附
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分 成 两 池 ， 加 入 接 头 A， B
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AAAAAA TБайду номын сангаасTTTT
标签酶酶切，释放标签，末端补平
B
CATG GTAC
平端连接
CATG GTAC
B
PCR扩 增 ， 锚 定 酶 酶 切
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（SAGE）是一种 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术。
SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。
CATG GTAC
A
CATG GTAC
B
CATG GTAC
A
CATG GTAC
A
CATG GTAC
CATG
CATG GTAC
mRNA 生 物 素 酰 化 的 Oligo-dT引 导 合 成 cDNA双 链
策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)
20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生
用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用， 筛选转录调控因子。
第六章 分子生物学研究法（下）
——基因功能研究技术
本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技 术和方法，比如通过这些方法研究：
（1）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶 段或在不同环境下的表达模式；
（2）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因 功能；
（3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。
6.1 基因表达研究技术
6.1.4 基因定点突变技术
基因定点突变技术常用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元 件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位 点等。
主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变 法。
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理
*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。 *现代遗传学：从基因序列出发，推测表型， 从而推导出该基因功能。
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。
酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
GTAC 连接，形成多联体
CATG GTAC
克隆，测序
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥实现
真核生物的转录因子大多是由两个结构 上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD）， 其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般 情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游 的 特 定 DNA 区 段 （ UAS ） 相 结 合 ， AD 则 推 动了转录起始。
特点：可识别稳定。
原理：
将已知的特定顺式作用元件构建到带 有报告基因最基本启动子(pmin)的上游， 然后编码待测转录因子cDNA与已知酵母 转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵 母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用 元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报 告基因得到表达。
激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布
6.1.3 原位杂交技术
原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射 自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一 种方法。
RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记 的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应， 从而对该基因的表达进行定性定量分析。
基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确 的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色 体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
1、完全基因敲除
完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞 或动物个体中的靶基因活性。
一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据 正负双向选择原理进行完全基因敲除。
荧光原位杂交（FISH）
荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非 放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是 首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克 隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
发现新的可变剪接体（splice variant），确 定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意 义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个 重要特征。
BTLAs（BTLA splice variant）
BTLA剪接体基因的结构分析 RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果
BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比对及其结构分析
BTLAi和BTLA跨膜预测
BTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLAi; B: BTLA
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
图6-9；图6-10。
2、条件型基因敲除
条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定 时间和空间的基因敲除。
对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有 关基因功能的研究无法开展。
Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。 图6-11。
图6-11 条件型基因敲除策略
图6-12 基因敲除 的主要技术
锚 定 酶 （ 设 为 Nla)酶 切 ， 磁 珠 吸 附
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分 成 两 池 ， 加 入 接 头 A， B
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AAAAAA TБайду номын сангаасTTTT
标签酶酶切，释放标签，末端补平
B
CATG GTAC
平端连接
CATG GTAC
B
PCR扩 增 ， 锚 定 酶 酶 切
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（SAGE）是一种 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术。
SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。
CATG GTAC
A
CATG GTAC
B
CATG GTAC
A
CATG GTAC
A
CATG GTAC
CATG
CATG GTAC
mRNA 生 物 素 酰 化 的 Oligo-dT引 导 合 成 cDNA双 链
策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)
20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生
用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用， 筛选转录调控因子。
第六章 分子生物学研究法（下）
——基因功能研究技术
本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技 术和方法，比如通过这些方法研究：
（1）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶 段或在不同环境下的表达模式；
（2）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因 功能；
（3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。
6.1 基因表达研究技术
6.1.4 基因定点突变技术
基因定点突变技术常用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元 件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位 点等。
主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变 法。
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理
*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。 *现代遗传学：从基因序列出发，推测表型， 从而推导出该基因功能。
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。
酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
GTAC 连接，形成多联体
CATG GTAC
克隆，测序
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥实现
真核生物的转录因子大多是由两个结构 上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD）， 其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般 情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游 的 特 定 DNA 区 段 （ UAS ） 相 结 合 ， AD 则 推 动了转录起始。
特点：可识别稳定。
原理：
将已知的特定顺式作用元件构建到带 有报告基因最基本启动子(pmin)的上游， 然后编码待测转录因子cDNA与已知酵母 转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵 母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用 元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报 告基因得到表达。
激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布
6.1.3 原位杂交技术
原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射 自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一 种方法。
RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记 的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应， 从而对该基因的表达进行定性定量分析。
基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确 的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色 体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
1、完全基因敲除
完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞 或动物个体中的靶基因活性。
一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据 正负双向选择原理进行完全基因敲除。
荧光原位杂交（FISH）
荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非 放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是 首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克 隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
发现新的可变剪接体（splice variant），确 定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意 义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个 重要特征。
BTLAs（BTLA splice variant）
BTLA剪接体基因的结构分析 RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果
BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比对及其结构分析
BTLAi和BTLA跨膜预测
BTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLAi; B: BTLA
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
图6-9；图6-10。
2、条件型基因敲除
条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定 时间和空间的基因敲除。
对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有 关基因功能的研究无法开展。
Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。 图6-11。
图6-11 条件型基因敲除策略
图6-12 基因敲除 的主要技术