产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选

产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选
1.目的要求
(1)熟悉产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选方法
(2)了解乳酸菌产胞外多糖的基本原理
2.基本原理
微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的荚膜多糖或黏液多糖，属于微生物的次级代谢产物。

微生物EPS是一种长链、高分子质量的聚合物，甚独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业备受青睐，尤其是它在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。

自然界中能产生多糖的微生物种类很多，涉及细菌、酵母和丝状真菌。

长久以来，乳酸菌用于发酵乳的生产，通常认为乳酸菌EPS安全性更为可靠，而且乳酸菌作为生理功能调节剂，利用益生菌制成活菌制剂，省去常规发酵、提取等繁琐工艺。

因此，开发乳酸菌EPS较其他微生物EPS来说，更具有理论意义与实际价值。

多糖难溶于乙醇，因此如果乙醇溶液中有絮状沉淀出现，通常可认为样品中含有多糖。

本实验就是利用多糖的这种性质来沉淀分离微生物EPS以供下一步的多糖检测。

目前用于多糖检测的方法较多，主要有干燥称重法、硫酸一蒽酮法、DNS(3, 5一二硝基水杨酸）法、苯酚一硫酸法、相对黏度法和Imshenetskii等报道的浊度法等。

由于苯酚一硫酸法具有简单方便、显色稳定、灵敏度高、重现性好、不受蛋白质干扰等优点而深受欢迎。

其原理是根据苯酚一硫酸试剂与游离的寡糖和多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）发生的显色反应。

己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

具体操作见实验步骤。

本实验利用多糖难溶于乙醇的性质来沉淀分离微生物EPS。

本实验以乳制品和肉制品为初始原料，分离产EPS的乳酸菌菌株并筛选高产EPS的优良菌株。

3实验材料
3.1原料从市场上购买的乳制品、肉制品。

3.2培养基MRS液体培养基、固体培养基（1.5％琼脂）。

3.3主要试剂6％苯酚，（临用前用80％苯酚配制）、浓硫酸。

3.4器材普通光学显微镜、电热恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽消毒器、高速离心机、分光光度计
4实验方法与步骤
4.1菌种的分离各样品分别称量25 g，粉碎，溶解于225 ml无菌生理盐水中，振荡均匀，得到10-1的菌悬液。

取1 ml此菌悬液，逐级稀释，直到10-8，并将不同稀释度的菌液各1 ml倒入平板，加入约15 ml含有CaCO3的MRS培养基中，轻轻水平转动混匀，待凝固后37℃恒温培养。

(周一)
4.2初筛24 h培养后取出观察，观察产生乳酸溶解圈的菌落，那些表面黏稠或者周围有扩散现象的单菌落，菌落呈圆形，用接种环挑取时可见明显的黏性，疑为胞外多糖。

革兰氏染色并进行显微观察，筛选出形态较好的菌株。

(周二)
4.3复筛将已经挑选出的菌株接种于MRS液体管内，37℃活化培养，苯酚一硫酸法检测其24 h 的发酵液内所产EPS的量并进行比较，筛选出产EPS相对较多的乳酸菌。

检测具体方法如下列步骤。

4.4标准曲线的制作准确称取标准葡萄糖20 mg于500 ml容量瓶中，加水至刻度。

各种试剂按照表所示的量加入试管中后，静置10 min，摇匀，室温放置20 min以后于490nm波长下检测光密度，以2.0 ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

(周一)
4.5多糖的检测取培养24 h的发酵液，8000r/min离心10 min，取上清液加入3倍体积的95％冷乙醇，4℃过夜后，10000r/min离心10 min，收集沉淀，蒸馏水溶解，并对蒸馏水透析过夜。

苯酚一硫
酸法检测490nm处的吸光值，计算EPS的量，筛选出高产EPS的乳酸菌菌株。

(周二——周三)
4.6平板划线分离纯化菌种保存
(周三、周四、周五)
5实验结果
记录初筛时产黏菌落标号及复筛时每种菌所产EPS的量，标记出所产EPS明显多于其他菌株的菌
株标号于下表。

6注意事项
(1)检测过程所用的6％苯酚，是临用前用80％的苯酚配制的。

故实验前，应用重蒸酚配制80％苯酚，4℃保存。

(2)在进行多糖检测时，其检测的浓度依具体情况而定。

一般以最终的多糖溶液接近无色为准，若样品浓度过高，其吸光值会超出线性范围，准确性差。

(3)由于苯酚及浓硫酸的腐蚀性，实验过程应注意自身安全。

7思考题
(1) MRS液体培养基中的碳源是否会影响实验的最终结果，实验中的哪些步骤可以减少此影响？还有什么其他的办法可以消除培养基中碳源的残留？
(2）结合苯酚一硫酸法检测多糖的原理，思考检测EPS时采用490nm作为检测波长，是否合理？为
什么？。