蛋白质定向进化技术优秀课件

蛋白质定向进化技术
●DNA改组
DNA改组又称有性PCR，目的是创造将亲本基因 群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异， 最终获得最佳突变组合的蛋白质。
蛋白质定向进化技术
●杂合蛋白质
把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子 进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化蛋 白质杂合体。
蛋白质定向进化技术
Miyazaki 等为了适应生产化需要 ，综合了随机突变、 定点饱和突变和 DN A 重组的方法 ，将 11家族木聚糖酶 进行改造以提高其热稳定性。最终得到的突变体的半热变 性温度从 58 ℃提高到 68℃，最适温度也从 55 ℃升到了 65 ℃ ，同时在 60 ℃的热稳定性也明显增强。
蛋白质定向进化技术
g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活性的酶。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） ★原理（theory） ★随机突变的策略（marked features） ★定向进化的选择的策略（methods） ★应用及展望（application and prospects）
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
（2）1998年，Arnold等运用易错PCR和饱和诱变 的方法 ，成功地使一株倾向于 D -型底物的乙内 酰脲酶发生转变 ，使之变为倾向于 L - 型底物， 经过分析这种转变只生发了一个氨基酸的替换 。 与野生型的催化蛋白相比，增加了 L - 甲硫氨酸 的产量，降低了不必要的产物积累。
Potocki — Veronese等利用易错 P C R和 DNA 重组技术对其 进行突变 ，得到催化蔗糖活性提高 6 0 ％ 的突变体 A s n 3 8 7 A s p ，从而扩大其 应用范围，在实际生产中具有重要意义 。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
◆提高酶的稳定性
Xiao等运用序列比对的结果为指导，进行定点突变 ，得 到突变体的 Tm值提高了 6 ℃，同时在不影响原有催化活 性的基础上，在 45 ℃时的半衰期比原酶提高了23倍之多。
定义
定向进化技术是一种在生物体体外 ( 试管 中) 模拟达尔文进化 ，利用自然选择的动 力进化出在自然界并不存在的或是具有更 优性质的蛋白。
蛋白质定向进化技术
自然选择
分子定向 进化
生物在漫长的时间 里经过自发突变（突变 与重组），通过自然选 择，逐渐形成了多样性 的生物。
自发、不定向、自然选择、慢
定向进化的展望
不仅能使蛋白质进化出非天然特性，还能定 向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单 一优良特性的蛋白质，还可能是已分别优化 的蛋白质的两个或多个特性叠加，产生具有 多项优化功能的蛋白质，进而发展和丰富蛋 白质资源；完全在试管中进行的蛋白质的体 外定向进化使在自然界需要几百万年的进化 过程缩短至几年。
蛋白质定向进化技 术
蛋白质定向进化技术
DE（directed evolution of protein）始于上 世纪70年代，最早的一个例子是进化一个来源于
大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎不具备 β-
半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一碳源的平 板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生型的 E b
◆改变酶的底物特异性
Manu等通过对纤维二糖磷酸化酶 (CP) 进行易错 P C R 筛选 ，得到的突变株作用底物从传统的纤维二糖转变成 了乳糖 ，随即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最终得到的 突变体菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了1 0倍 。
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◆改变对映异构体特异性
（1）Schmidt 等选用易错 P C R技术将来源于 Pseudomonas fluoresce ~ 酯酶的对应选择性野 生型的E值从 63提高至 96 ，同时活性也相应的 增加了， 能够达到 2 mi n转化 50 ％的底物， 相 当于 1．25 U／mg 的蛋白量。
基因在短时间内通 过人为引发突变，经过 人工筛选，形成满足人 们需要的新功能或者优 良性能生物物质（酶蛋
白）
人为、定向、人工选择、快
蛋白质定向进化技术
原理
DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和 筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程, 获取 人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。
定向进化=随机突变+选择
蛋白质定向进化的应用及展望
●提高酶的催化活性 ●提高酶的稳定性 ●改变酶的底物特异性 ●改变对映异构体特异性
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◆提高酶的催化活性
Shim 等采用定点突变技术构建的突变体 ，改 变了位于酶活性中心 “蛋白-s -结合 ” 口袋中 Me t -3 1 7 ，并突变为Ala ，从而有利于底物范 围的扩大；
随机突变的策略
■易错 PCR ■ DNA改组和外显子改组 ■杂合蛋白质 ■体外随机引发重组 ■交错延伸
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●易错 P C R
易错 P C R是指通过改变 P C R的反应 条件，如： 调整反应体系中4种 d NTP的浓度、增加Mg 2+ 的 浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多 点突变，构建突变库，刷出所需的突变体。易错 P C R的关键是控制D N A的突变频率。
●体外随机引发重组
以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先 产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由 于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也 会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们 互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的 基因长度。
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●交错延伸 一种简化的 D N A 重组方法，它不是由短片段组 装全长基因，而是在 PCR反应中，将含不同点突 变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及 延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的片段可 以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸， 由于模板转换而实现不同模板间的重组，如此重 复直至获得全长基因片段。
定向进化的选择策略
Venekei等人报道了有效快速筛选蛋白水解酶突变 体的方法和筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平 板初选，再配合活性染色和X-光片消灭分析加以 验证，并检测其活力快速筛选了44000个突变株。 Roberts等人用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性 酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体 的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋 白质3600000倍的突变体，比已报道的任何一个 相应的抑制剂高50倍。