蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化的应用
蛋白质定向进化的应用蛋白质是生命机体中的重要组成部分，它们具有多种功能，如催化和传递信息。
由于蛋白质的功能对其三维结构的高度依赖性，因此对蛋白质结构的精确预测是重要的，并且可以用于设计特定功能的蛋白质。
蛋白质定向进化是一种基于自然选择原理的技术，通过连续的循环实验和计算，驱动蛋白质序列的变异和选择，以寻找蛋白质的最佳性能，被广泛应用于蛋白质结构预测和设计等领域。
一、蛋白质定向进化的原理蛋白质的性质和功能主要由其序列和结构决定。
在蛋白质定向进化中，需要根据目标蛋白质的性质和功能，构建一个“库（library）”。
这个“库”包括多个具有不同序列的蛋白质变异体，这些变异体的序列与目标蛋白质序列相似，但稍有不同。
接下来，需要通过一系列实验和计算，在这个“库”中筛选出最佳的蛋白质变异体。
具体地，蛋白质定向进化的原理包括以下三个步骤：1. 随机变异初始蛋白质库中的每个蛋白质都经过随机突变，以引入多样性。
2. 挑选采用高通量筛选方法遴选具有所需性状、性能或者特征的蛋白质变异体。
3. 迭代经过多次重复实验和计算，对最佳选择进行进一步的探索和优化，直到达到所需性能的蛋白质为止。
二、蛋白质定向进化在药物开发中的应用药物开发是蛋白质定向进化的一个重要应用领域。
在药物研发过程中，需要设计出具有特定生物活性的化合物，同时需要考虑化合物与目标蛋白质之间的相互作用，以及化合物在体内的药代动力学性质等因素。
由于药物分子的设计是基于目标蛋白质的结构和功能，因此蛋白质定向进化的技术可用于设计新型药物分子。
举个例子，最初发现的HIV-1整合酶抑制剂有着许多缺陷，无法满足药物研发的需求。
研究人员使用蛋白质定向进化的方法对该酶进行了优化，成功开发了速效、低毒性的药物达文西普（DavinCyp）。
这表明，蛋白质定向进化技术可以用于开发高效、低毒性的药物，使药物研发更加高效和有成效。
三、蛋白质定向进化在合成生物学中的应用合成生物学是通过将基因、蛋白质和代谢通路组合在一起，构建能够实现特定功能的新型细胞系统。
蛋白质的体外定向进化
蛋白质的体外定向进化概述蛋白质是生物体中起着重要作用的大分子有机化合物，具有广泛的生物功能。
研究人员通过对蛋白质结构与功能的深入探索，不仅能够揭示生命的奥秘，还能够为药物设计和工业生产等领域提供重要的指导。
然而，天然界中存在的蛋白质种类有限，无法满足人们日益增长的需求。
因此，开发新型蛋白质成为现代生物科学的热点之一。
蛋白质的设计与进化是一项关键性的工作。
体外定向进化是一种重要的蛋白质工程技术，通过在体外模拟自然界的进化过程，使蛋白质的性质得以改良和优化，以满足特定的应用需求。
蛋白质的体外定向进化流程蛋白质的体外定向进化通常包括以下步骤：1.库构建：首先，需要构建一个包含大量变异蛋白质的基因库。
这可以通过人工合成DNA序列、使用随机突变或利用现有的蛋白质序列进行改造等方式实现。
2.库筛选：将基因库中的变异蛋白质表达出来，并通过适当的筛选方法对其进行选择。
常见的筛选方法包括亲和层析、抗体标记、酶活性测定等。
3.评估鉴定：对筛选出的蛋白质进行鉴定，包括测定其结构、功能和稳定性等性质，并与天然蛋白质进行比较分析。
需要特别注意的是，鉴定过程中需要采用一系列的生物化学和生物物理方法，如质谱、光谱和动力学分析等。
4.优化进化：基于初步筛选和评估鉴定的结果，对筛选出的蛋白质进行进一步的优化和进化。
这可以通过遗传算法、DNA重组技术、蛋白质工程等手段实现。
5.验证应用：最后，对优化后的蛋白质进行进一步的验证和应用，包括在生物医学研究、产业生产以及药物设计等领域的应用。
蛋白质的体外定向进化方法和技术蛋白质的体外定向进化涉及到多种方法和技术，以下是其中的一些常用手段：1.串联重组：将不同的蛋白质片段通过连接肽链的方式进行重组，生成具有新功能的蛋白质。
2.随机突变：利用化学方法或遗传方法对蛋白质的氨基酸序列进行随机改造，产生大量的变异蛋白质。
3.异源进化：将蛋白质序列从一个物种转移到另一个物种，通过适应新的环境条件，使其获得新的功能。
蛋白质定向进化
蛋白质定向进化随着科技的不断进步，蛋白质定向进化技术成为了现代科学研究领域中的一个重要工具。
蛋白质是细胞体内的基本生物分子之一，其不同的结构和功能使得它们在细胞工作中具有重要性。
蛋白质定向进化技术通过改变蛋白质的氨基酸序列来改变其性质，从而实现更好的功能。
蛋白质定向进化技术是建立在“随机突变-筛选”的基础上的，其核心思想是通过改变蛋白质的氨基酸序列，从而使其具有更好的性质。
在蛋白质定向进化的过程中，需要基于一些目标函数来确定理想的性质以及优化方案。
这些目标函数可以是特定的性质，如热稳定性、酸碱稳定性、活性选择，也可以是针对特定应用领域的属性。
蛋白质定向进化的关键步骤包括随机突变、挑选和筛选。
随机突变通常使用 PCR、DNA测序和基因克隆技术来生成一系列具有变异突变的蛋白质序列。
接下来，选取具有预期性能的变异序列开始筛选工作，从而确认蛋白质性能的改进情况，再进一步筛选出合适的蛋白质序列。
筛选过程一般使用高通量筛选技术，如流式细胞术和免疫学筛选技术。
最终，鉴定出的蛋白质序列被克隆并表达，这些蛋白质随后可以进行进一步的物理化学性质和活性测试。
然而，蛋白质定向进化技术也面临着一些挑战。
一方面，蛋白质的稳定性和活性有时不容易被直接监测到，因此需要将这些特性进行精细的调控。
另一方面，快速育种随之带来了对蛋白质的大规模筛选，这意味着高通量筛选技术的发展越来越受到各界的关注和需求。
总之，蛋白质定向进化技术已成为现代科学研究领域中的一个重要研究课题。
通过对蛋白质进行有目的的突变和筛选，可以实现改进蛋白质的性能，促进其在细胞工作中的应用。
这种技术的进一步发展和完善，将为解决许多生物学上的难题，以及推动新药物开发和疾病治疗打下坚实基础。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化一、前言蛋白质是生命体系中最基本的分子之一，也是生物学研究的重要对象。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质工程技术也得到了快速发展。
其中，蛋白质工程定向进化技术是一种重要的手段，可以用于改良蛋白质性质或者合成新的功能性蛋白质。
本文将对蛋白质工程定向进化技术进行详细介绍。
二、蛋白质工程定向进化技术概述1. 蛋白质工程简介蛋白质工程是指通过人为设计和改造来改变蛋白质的结构和功能，以满足特定需求的一种技术。
它主要包括两个方面：基因重组技术和突变策略。
基因重组技术主要通过DNA重组来改变目标基因序列从而实现目标蛋白表达；突变策略则主要通过引入突变来改变目标蛋白的结构和功能。
2. 定向进化简介定向进化（Directed Evolution）是一种利用自然选择原理加速分子优化的方法。
它通过在大量变异体中筛选出具有所需性质的分子，进而实现对分子性质的改良和优化。
定向进化可以应用于各种生物分子，如蛋白质、核酸等。
3. 蛋白质工程定向进化技术蛋白质工程定向进化技术是将蛋白质工程和定向进化结合起来的一种手段。
它通过引入随机突变和筛选来改变目标蛋白的结构和功能，从而实现对目标蛋白性质的改良和优化。
三、蛋白质工程定向进化技术原理1. 随机突变随机突变是指在目标基因序列中引入随机变异，使得产生大量具有不同性状的突变体。
随机突变可以通过多种方式实现，如自然突变、PCR扩增等。
2. 筛选筛选是指在大量随机突变体中选择具有所需性状的分子。
筛选方法包括：基于酶活性或者细胞生存能力等可测量特征进行筛选；利用选择压力诱导所需特征表达等。
3. 重复迭代重复迭代是指不断进行随机突变和筛选，以逐步优化分子性状。
这个过程需要进行多次，每一轮都会产生新的突变体，进而实现对分子性质的改良和优化。
四、蛋白质工程定向进化技术应用1. 蛋白质结构优化蛋白质工程定向进化技术可以用于优化蛋白质结构，从而提高其稳定性和活性。
例如，通过引入突变来改变酶的催化活性中心的位置和大小，从而提高酶的催化效率。
蛋白质定向进化
蛋白质定向进化近几年，蛋白质定向进化技术正在快速发展，它能够改变蛋白质和其他生物分子的性能，从而实现有效的研究和应用。
本文将专注于蛋白质定向进化的基本原理，应用，以及其未来发展潜力。
蛋白质定向进化是什么？蛋白质定向进化（Protein Directed Evolution，简称PDE）是一种新型的生物技术，可以通过模拟自然选择和中和进化的过程，来改变蛋白质的性质，通过定向改变蛋白质的活性，稳定性等特性，以达到更高的性能。
蛋白质定向进化的原理蛋白质定向进化的基本原理是，通过对蛋白质的大量变异，然后根据突变后蛋白质的性质选择性保留最有价值的蛋白，然后再次进行变异，达到不断改善蛋白质性能的目的。
通常，变异过程通过分子生物学和其他实验手段实现，而在每一代变异后，将蛋白质通过筛选的方法从细菌中纯化出来，从而构建一个“定向进化的蛋白质系列”。
蛋白质定向进化的应用蛋白质定向进化技术可以用来改善蛋白质的活性、稳定性、过氧化物酶催化活性、受体特异性、抗性等特性。
此，PDE技术可用于制备药物靶点蛋白质，有助于开发新型抗生素、癌症药物及噬菌体。
此外，PDE技术也可用于蛋白质类催化剂的开发，以及蛋白质传感器、抗原、发酵食品等的改良。
未来的发展未来的发展趋势是，蛋白质定向进化技术将进一步改进，将细菌中的蛋白质进行大规模多维度突变，进一步提高突变后蛋白质的性能。
此外，人工智能（AI）也将成为PDE技术的重要组成部分，能够大大提高PDE技术的效率。
而在生物制药中，PDE技术也有望成为一种有效的工具，以改善传统药物开发中存在的问题，提高新药研发的有效性。
总结总之，蛋白质定向进化技术可以通过模拟大自然选择和中和进化的过程，对蛋白质进行大量变异，从而获得具有更完善性能的蛋白质，并可以改进传统药物开发中存在的问题，提高新药研发的有效性，因此未来的发展前景十分可观。
定向进化技术在蛋白质工程中的应用
定向进化技术在蛋白质工程中的应用随着生物技术领域的不断发展，蛋白质工程成为了一个重要的研究方向。
蛋白质工程是指使用现代生物技术手段对蛋白质进行结构、功能及表达等方面的改良，以获得更适合实际应用的蛋白质。
定向进化技术是蛋白质工程中最常用的一种技术，它能够快速、高效地筛选出所需要的蛋白质，被广泛应用于药物研发、生物工程及制药等领域。
一、定向进化技术的基本原理定向进化技术是利用基因重组技术获取大量的突变体库，筛选出在某些条件下转化率、酶活和反应特异性改进的突变体，并定位到对应的氨基酸位点，再利用基因突变技术将这些筛选出来的特异性位点进行组合，进一步的改进，最终得到特定的蛋白质，以增加蛋白质的适应性和功能。
二、定向进化技术的应用1. 蛋白质功能改良及靶向药物开发由于生物体内合成的蛋白质存在着诸多的限制和缺陷，使得其功能和性质无法满足工业和医药等领域的需求。
为了获得更好的蛋白质性质，科学家利用定向进化技术将现有蛋白质进行改良和组合，得到了基于蛋白质不同结构域的新功能蛋白质。
其中，最有代表性的便是抗体结构域改良。
2. 分子酶学的研究利用定向进化技术，可以实现对酶活所涉及的氨基酸在以往的突变实验中无法取得突变株的重组体或蛋白质库的转化，使用突变库来筛选出突变体，从而获得了酶活和结构上的改良，在表达、活性、稳定性等方面均存在了极大地改善。
3. 蛋白质结构的研究利用定向进化技术可以使蛋白质结构发生变化，如找到蛋白质中存在的特定位点，改变其氨基酸的序列，从而进一步研究蛋白质的结构及其功能。
三、定向进化技术的优势定向进化技术不仅可以快速、准确地筛选出所需的蛋白质，还能够针对不同的研究方向进行优化和改进，具有以下优势：1. 稳定性好定向进化技术可以大幅提高蛋白质的稳定性和活性，适合用于药物、医学和工业等领域的生产和应用。
2. 可定向优化由于定向进化技术可以指导特定氨基酸的改变，有利于用户对蛋白质结构和性质进行定向优化和调整。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化概述蛋白质工程定向进化是一种通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构，从而创造新的功能和性质的生物技术方法。
其在药物研发、酶工程和功能蛋白设计等领域具有广泛的应用。
蛋白质工程定向进化的基本原理蛋白质工程定向进化的基本原理是通过模拟自然界中的进化过程，从大量的蛋白质变异体中筛选出具有特定功能和性质的蛋白质。
1. 构建蛋白质变异库为了利用蛋白质工程定向进化的方法，首先需要构建一个包含大量蛋白质变异体的库。
这可以通过多种方法实现，如随机突变、DNA重组和基因片段替换等。
2. 筛选和筛选条件优化构建蛋白质变异库后，需要使用适当的筛选方法和筛选条件来筛选出具有所需功能和性质的蛋白质。
筛选方法可以是高通量筛选、酶活性测定、抗体结合等。
为了提高筛选效率，还可以通过筛选条件的优化来改进筛选系统。
例如，可调节温度、pH值、盐浓度等条件，以提高筛选的灵敏度和特异性。
3. 进一步优化和改良从筛选中获得的蛋白质变异体可能仍然存在改良的空间。
这时可以通过进一步的蛋白质优化和工程来改善其性能。
常见的优化方法包括有限制性水解、点突变、插入和删除氨基酸等。
优化的目标通常是提高蛋白质的稳定性、活性和选择性。
蛋白质工程定向进化在药物研发中的应用蛋白质工程定向进化在药物研发中具有重要的应用价值。
通过改变蛋白质的结构和功能，可以获得具有更好疗效和更低副作用的药物。
1. 抗体药物定向进化可以用于提高抗体药物的亲和力和特异性。
通过对抗体的变异和选择，可以获得更好的结合亲和力和更低的非特异性结合，从而提高药物的疗效和安全性。
2. 酶替代治疗定向进化也可以用于改进酶替代治疗的效果。
通过改变酶的催化效率、稳定性和特异性，可以获得更有效的酶替代治疗药物。
3. 蛋白质药物输送蛋白质工程定向进化还可以用于改进蛋白质药物的输送系统。
通过改变蛋白质的结构和亲和性，可以实现药物的准确输送和控制释放。
蛋白质工程定向进化在酶工程中的应用蛋白质工程定向进化在酶工程中也具有广泛的应用。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 个来源于大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎 A蛋白， 不具备 β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一 碳源的平板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生 c型的 E b g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活 A就进化成为了具有 性的酶。
蛋白质定向进化技术 （DE technology of Protein）
108032008105--108032008120 108032008105--108032008120
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） 定义（definition） ★原理（theory） 原理（theory） ★显著特征（marked features） 显著特征（mar法（methods） ★筛选方法（screening technique） 选方法（ technique） ★应用及展望（application and prospects） 应用及展望（application prospects）
蛋白质定向进化技术
频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；太低 ， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于 每一 D N A序列来说，合理的碱基突变数是 1-3 。 A序列来说，合理的碱基突变数是 理想的碱基置换率和易错P R的最佳条件则依赖 理想的碱基置换率和易错P C R的最佳条件则依赖 于随机突变的目标 D N A片段的长度。 A片段的长度。
蛋白质定向进化技术
当 D N A s h u f f l i n g用来重组一套进化上相 g用来重组一套进化上相 关的基因时 ，又被称为 f ami l y s h u f f l i n g 。 N I 等用 family shuffling对同源性为 7 8 . 5 ％ shuffling对同源性为 -9 6 ％ 4种白蚁的 3 O--3 O 倍。
蛋白质定向进化的研究及其应用
蛋白质定向进化的研究及其应用蛋白质是生命体中不可缺少的有机分子，是构成细胞和组织的基本构件，承担着多种生物学功能。
为了更好地利用这种生物学功能，人类通过对蛋白质的研究，不断地探索和应用，在此过程中，蛋白质定向进化成为了一种研究热点。
一、蛋白质定向进化的概念蛋白质定向进化是指通过人工干预蛋白质的进化过程，使得蛋白质具有特定的理化性质和生物学功能的进化过程。
这是一种通过人为干预蛋白质进化，来满足特定生物学需求的新型技术。
蛋白质定向进化的研究内容包括蛋白质结构、功能、稳定性等重要性质，通过对这些重要性质的控制，可以得到具有理想性质的蛋白质，从而实现对生物学系统的调控和改造。
二、蛋白质定向进化的优缺点蛋白质定向进化能够为科学家提供一种有效的蛋白质改造手段。
通过干预蛋白质进化，能够快速地合成新型蛋白质结构和功能，从而为人类提供了一种快速开发新型药物和工艺技术的有效手段。
蛋白质定向进化的研究还有其他种种应用，比如制药、工业生产等。
与此同时，蛋白质定向进化也存在一些瓶颈和问题。
首先，这种技术需要大量的试验和评估，费用往往比较高，花费时间也较长。
同时，基于蛋白质定向进化的研究，可能会涉及到一些生物伦理和道德方面的问题，比如人工合成蛋白质是否会对人类产生影响等问题，需要更加严谨地探讨和研究。
三、蛋白质定向进化的应用前景蛋白质定向进化作为一种新型技术，具有广泛的应用前景。
在生物制药领域，蛋白质定向进化技术可以用于合成更加精准和高效的药物，可以提高治疗效果，减少不良反应。
在工业制造领域，蛋白质定向进化技术可以用于生产高效节能的工业碳酸饮料，提高生产效率。
未来，蛋白质定向进化技术可能会成为一种重要的生物技术。
在此过程中，人类可以通过这种研究方法不断创新和发展自身的科技水平，为人类的健康和生活水平的提高，提供更为坚实的科学基础。
四、结语总之，蛋白质定向进化是生物技术发展的一种重要趋势。
在将来的发展中，我们可以通过加强蛋白质定向进化研究，更好地利用生物资源，推动更为先进和高效的生物技术的应用，促进人类文明和科技的共同发展。
蛋白质定向进化技术
℃时的半衰期比原酶提高了23倍之多。 ★定义（definition） ◆改变对映异构体特异性
（1）Schmidt 等选用易错 P C R技术将来源于 Pseudomonas fluoresce ~ 酯酶的对应选择性野生型的E值从 63提高至 96 ，同时活性 也相应的增加了， 能够达到 2 mi n转化 50 ％的底物， 相当于 1．25 U／mg 的蛋白量。 在新药和疫苗开发中的应用
随机突变的策略
■易错 PCR ■ DNA改组和外显子改组 ■杂合蛋白质 ■体外随机引发重组 ■交错延伸
蛋白质定向进化技术
●易错 P C R
易错 P C R是指通过改变 P C R的反应 条件，如 ： 调整反应体系中4种 d NTP的浓度、增加Mg 2+ 的浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入 多点突变，构建突变库，刷出所需的突变体。易 错 P C R的关键是控制D N A的突变频率。
把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子 ●改变对映异构体特异性
★随机突变的策略（marked features） ◆提高酶的催化活性
进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化蛋 Shim 等采用定点突变技术构建的突变体 ，改变了位于酶活性中心 “蛋白-s -结合 ” 口袋中 Me t -3 1 7 ，并突变为Ala ，从而有利
蛋白质定向进化技术
●体外随机引发重组
以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先 产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由 于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也 会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们 互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的 基因长度。
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定向进化的选择策略
Venekei等人报道了有效快速筛选蛋白水解酶突变 体的方法和筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平 板初选，再配合活性染色和X-光片消灭分析加以 验证，并检测其活力快速筛选了44000个突变株。 Roberts等人用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性 酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体 的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋 白质3600000倍的突变体，比已报道的任何一个 相应的抑制剂高50倍。
定向进化的展望
不仅能使蛋白质进化出非天然特性，还能定 向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单 一优良特性的蛋白质，还可能是已分别优化 的蛋白质的两个或多个特性叠加，产生具有 多项优化功能的蛋白质，进而发展和丰富蛋 白质资源；完全在试管中进行的蛋白质的体 外定向进化使在自然界需要几百万年的进化 过程缩短至几年。
Miyazaki 等为了适应生产化需要 ，综合了随机突变、 定点饱和突变和 DN A 重组的方法 ，将 11家族木聚糖酶 进行改造以提高其热稳定性。最终得到的突变体的半热变 性温度从 58 ℃提高到 68℃，最适温度也从 55 ℃升到了 65 ℃ ，同时在 60 ℃的热稳定性也明显增强。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
●交错延伸 一种简化的 D N A 重组方法，它不是由短片段组 装全长基因，而是在 PCR反应中，将含不同点突 变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及 延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的片段可 以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸， 由于模板转换而实现不同模板间的重组，如此重 复直至获得全长基因片段。
原理
DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和 筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程, 获取 人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。
定向进化=随机突变+选择
随机突变的策略
■易错 PCR ■ DNA改组和外显子改组 ■杂合蛋白质 ■体外随机引发重组 P C R
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） ★原理（theory） ★随机突变的策略（marked features） ★定向进化的选择的策略（methods） ★应用及展望（application and prospects）
蛋白质定向进化技术
定义
定向进化技术是一种在生物体体外 ( 试管 中) 模拟达尔文进化 ，利用自然选择的动 力进化出在自然界并不存在的或是具有更 优性质的蛋白。
蛋白质定向进化技术
自然选择
分子定向 进化
生物在漫长的时 间里经过自发突变（ 突变与重组），通过 自然选择，逐渐形成 了多样性的生物。
自发、不定向、自然选择、慢
基因在短时间内 通过人为引发突变， 经过人工筛选，形成 满足人们需要的新功 能或者优良性能生物
物质（酶蛋白）
人为、定向、人工选择、快
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
DE（directed evolution of protein）始于上 世纪70年代，最早的一个例子是进化一个来源于
大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎不具备 β-
半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一碳源的平 板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生型的 E b
g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活性的酶。
◆改变酶的底物特异性
Manu等通过对纤维二糖磷酸化酶 (CP) 进行易错 P C R 筛选 ，得到的突变株作用底物从传统的纤维二糖转变成 了乳糖 ，随即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最终得到的 突变体菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了1 0倍 。
蛋白质定向进化技术
◆改变对映异构体特异性
（1）Schmidt 等选用易错 P C R技术将来源于 Pseudomonas fluoresce ~ 酯酶的对应选择性野 生型的E值从 63提高至 96 ，同时活性也相应的 增加了， 能够达到 2 mi n转化 50 ％的底物， 相 当于 1．25 U／mg 的蛋白量。
易错 P C R是指通过改变 P C R的反应 条件，如： 调整反应体系中4种 d NTP的浓度、增加Mg 2+ 的 浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多 点突变，构建突变库，刷出所需的突变体。易错 P C R的关键是控制D N A的突变频率。
蛋白质定向进化技术
●DNA改组
DNA改组又称有性PCR，目的是创造将亲本基因 群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异， 最终获得最佳突变组合的蛋白质。
蛋白质定向进化技术
（2）1998年，Arnold等运用易错PCR和饱和诱变 的方法 ，成功地使一株倾向于 D -型底物的乙内 酰脲酶发生转变 ，使之变为倾向于 L - 型底物， 经过分析这种转变只生发了一个氨基酸的替换 。 与野生型的催化蛋白相比，增加了 L - 甲硫氨酸 的产量，降低了不必要的产物积累。
蛋白质定向进化的应用及展望
●提高酶的催化活性 ●提高酶的稳定性 ●改变酶的底物特异性 ●改变对映异构体特异性
蛋白质定向进化技术
◆提高酶的催化活性
Shim 等采用定点突变技术构建的突变体 ，改 变了位于酶活性中心 “蛋白-s -结合 ” 口袋中 Me t -3 1 7 ，并突变为Ala ，从而有利于底物范 围的扩大；
蛋白质定向进化技术
●杂合蛋白质
把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子 进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化蛋 白质杂合体。
蛋白质定向进化技术
●体外随机引发重组
以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先 产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由 于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也 会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们 互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的 基因长度。
Potocki — Veronese等利用易错 P C R和 DNA 重组技术对其 进行突变 ，得到催化蔗糖活性提高 6 0 ％ 的突变体 A s n 3 8 7 A s p ，从而扩大其 应用范围，在实际生产中具有重要意义 。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
◆提高酶的稳定性
Xiao等运用序列比对的结果为指导，进行定点突变 ，得 到突变体的 Tm值提高了 6 ℃，同时在不影响原有催化活 性的基础上，在 45 ℃时的半衰期比原酶提高了23倍之多。