酶的定向进化

注：易错 PCR突变率需仔细调控，不能高低，靶基因取代碱基1.5~5个，经常一次突变很难获 得满意的结果。将一次易错 PCR获得的小突变累计产生重要的有益突变。
Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲 酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的 活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的 DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131 倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定 向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高 3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、 耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此 外, 使用该方法易出现同型碱基转换.
在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′ 校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突 变， 构建突变库。
连续易错PCR
连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反 复地进行随机诱变。
注：切割成随机片段，再进行不加引物的PCR循环，片段之间互为引物或模版，直到 获得全长的基因。该策略将亲本基因群中优势突变尽可能结合在一起。
DNA改组
该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变 尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终 获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和 “连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加 速积累有益突变〔9〕, 而且可使酶的2个或 更多的已优化性质合为一体〔10～15〕.
酶分子研究
认识与改造 改造： 合理设计（化学修饰、定点突变） 非合理设计（定向进化、杂合进化）
定向进化技术
人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突变， 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的 或者人为获得的）出发，经过基因的突变 和重组，构建一个人工突变酶库，通过一 定的筛选或选择方法最终获得预先期望的 具有某些特性的进化酶。
其他无性进化
化学诱导剂
65度下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，内切酶切下突 变了的基因片段，再克隆表达 致突变菌株 注：遗传变化只发生在单一分子内部属于无性进化
DNA改组
DNA改组(DNA shuffling) 又称有性PCR (sexual PCR)， 原理如图所示。
二、酶的定向进化简介
易错pcr、DNA改组、高突变菌株
蛋白质定向进化概念的提出
1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概念， 并用于天然酶的改造或构建新的非 天然酶。
定向进化与自然进化比较
自然进化非常缓慢，环境的多样性和适应方 式的多样性决定了进化方向的多样性。 定向进化模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组、筛选
Biblioteka Baidu 定向进化的原理
定向进化＝随机突变＋选择
随机突变的策略
易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一 种简化的DNA shuffling 技术
现代生物工程的要求
天然酶需各种生物分子之间协调，工业酶主要 考虑活力与稳定性，能具备长期稳定性和活性 天然酶作用环境与应用环境的差异，能适用于 水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成 底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药 物的原材料
如何利用相对简单的方法以 达到对天然酶的改造或构建新 的非天然酶就显得非常有研究 意义和应用前景。
利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限
随着酶催化应用范围的不断扩大和研究 的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确 性和有效性常常不能很好地满足酶学研究 和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定 性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有 商业价值的催化功能 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于 开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外 定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称 实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属 于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了 解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条 件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体 外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向 进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别 是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐 显示其生命力
酶的定向进化技术
一、定向进化的潜力
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应 得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎 所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这 样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
易错PCR
易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目 的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随 机突变。
PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72
易错 PCR
是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩 增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs 浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变 扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率 向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分 子的随机突变体。