分子生物学试验教学教案

分子生物学实验教学教案 (3000字)

河南科技大学

实验教学教案

课程名称分子生物学

指导教师李市场

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实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。实验原理将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：

1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

2. 质粒的质量和浓度: 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染。

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

一. 仪器控温摇床(37℃) 高速冷冻离心机

水浴锅冰箱（-20℃,‐70℃）

超净工作台培养箱(37℃)

752分光光度计灭菌锅

二. 试剂 CaCl2 无菌水,冰

胰蛋白胨酵母粉

Amp NaCl

三. 其他用品

移液器，枪头

1.5ml ,50ml 离心管三角瓶 500ml 200ml

6cm平皿试剂瓶60ml

量筒烧杯

琼脂甘油

酒精灯三角玻棒

酒精棉球火柴

［溶液配制］ 0.1 mol/L CaCl2溶液配置灭菌

LB液体培养基

氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成50_60 mg/mL溶液，抽

虑

灭菌置－20℃冰箱中保存。

四. 材料 E.coli.DH5α

质粒 DNA

五: 实验步骤：(CaCl2) （20人一班，分三组）

第一天：从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基

的试管中,37℃振荡培过夜。

第二天：

1. 取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养

2－3 h(此时，OD600 ≤ 0.4-0.5，细胞数务必≤108／mL。此为实验成

功的关键)

3. 将菌液转移到50 mL离心管中，冰上放置10 min。

4. 离心10 min（4000r/min）,回收细胞。4℃

5. 倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。

6. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 10 mL悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。

7. 0－4℃ 6000 r/min,离心10 min，回收细胞。

8. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2 mL悬浮细胞，（务必放在冰上）。

9. 分装细胞，每200 μL一份。此细胞为感受态细胞。

转化：

10. 取200 μL新鲜制备的感受态细胞，加入DNA 2 μL（50

ng ）混匀冰上放置30 min。

同时作两个对照管

受体菌对照：200 μL感受态细胞＋2 μL无菌水

质粒对照：200 μL 0.1 mol/L CaCl2溶液＋2 μL 质粒DNA 溶液

11 .将管放到42℃循环水浴1－2 min。

12. 冰浴2 min。

13. 每管加800 μL LB液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。

14. 将适当体积（200 μL）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。

15. 倒置平皿37℃培养12－16 h，出现菌落。

16.计算转化效率

关于大肠杆菌感受态细胞的制备及转化讲解：

1、感受态细胞的概念

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环

境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。