第七章_发酵过程控制12
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代谢参数按性质分可分三类: 物理参数:温度、搅拌转速、空气压力、空 气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧(二氧 化碳)浓度等
化学参数:基质浓度(包括糖、氮、磷)、 pH、产物浓度、核酸量等 生物参数:菌丝形态、菌浓度、菌体比生长 速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活 力等
从检测手段分可分为:直接参数、间接 参数 直接参数:通过仪器或其它分析手段可 以测得的参数,如温度、pH、残糖等
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中 菌体量的变化,一般前期菌浓增长很快,中期 菌浓基本恒定。补料会引起菌浓度的波动,这 也是衡量补料量适合与否的一个参数。
菌浓测定方法
测粘度
压缩体积法(离心)
静置沉降体积法 光密度测定法 OD600~660 适合于细 菌、酵母
7、产物浓度
在培养过程中,产生菌的合成能力和产 物积累情况都要通过产物量的测定来了 解,产物浓度直接反映了生产的状况, 是发酵控制的重要参数。而且通过计算 还可以得到生产速率和比生产速率,从 而分析发酵条件如补料、pH对产物形 成的影响。
迟滞期
对数生长期
稳
定 期
死亡期
1、比生长速率 若细胞物质或细胞数目增长一倍的时间间隔是 常数,则微生物是以指数速率增长,可用数学 模型来描述。 (1 ) (2 )
式(1)表明,细胞物质随时间的增加而增加 式(2)表明,细胞数目随时间的增加而增加
在大多数情况下,生长是以物质的增加衡量的, 因而得到应用。
2、研究的层次 初级层次的研究: 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目 的菌株生长和代谢的一般条件,如培养 基的组成、最适温度、最适pH等要求。 摇瓶研究的优点是工作量大,可以一次 试验几十种甚至几百种条件,对于菌种 培养条件的优化有较高的效率。
代谢及工程参数层次研究: 一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试 验的基础上,考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法 考察的参数,以及在反应器中微生物对各种 营养成分的利用速率、生长速率、产物合成 速率及其它一些发酵过程参数的变化,找出 过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中 全程参数的监控是连续的,所以得到的代谢 情况比较可信。
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。 糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力 菌体生长旺盛糖耗一定快,残糖也就降低得快。 通过糖含量的测定,可以控制菌体生长速率,可 控制补糖来调节pH,促进产物合成,不致于盲 目补糖,造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发 酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖指含有自由醛基的单糖,通常指的是 葡萄糖。
达到稳态后,整个过程中菌的浓度,产 物浓度,限制性基质浓度都是恒定的。
连续培养的优缺点 优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优 化。发酵周期长,得到高的产量。由于μ =D,通过改变稀释速率可以比较容易的 研究菌生长的动力学 缺点 菌种不稳定的话,长期连续培养会 引起菌种退化,降低产量。长时间补料染 菌机会大大增加。
3、半连续培养 在补料分批培养的基础上间歇放掉 部分发酵液(带放)称为半连续培 养。某些品种采取这种方式,如四 环素发酵 优点 放掉部分发酵液,再补入部分 料液,使代谢有害物得以稀释有利于 产物合成,提高了总产量。 缺点 代谢产生的前体物被稀释,提 取的总体积增大
4、连续培养 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出 等量的发酵液,使发酵罐内的体积维持 恒定。
目前发酵过程主要分析项目如下 1、pH pH与微生物的生命活动密切相关— — 酶催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综 合反映——基质代谢、产物合成、细 胞状态、营养状况、供氧状况
2、排气氧、排气CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用 以后还剩余的氧,因此排气氧的大小反映了 菌生长的活性,通过计算可以求得摄氧率 (OUR)。
第七章
发酵过程的代谢控制
发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点:过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种,同样的培养基在不同工厂,不 同批次会得到不同的结果,可见发酵过程的 影响因素是复杂的,比如设备的差别、水的 差别、培养基灭菌的差别,菌种保藏时间的 长短,发酵过程的细微差别都会引起微生物 代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一 般方法对于控制代谢是十分必要的
OUR=Qo2X
Qo2为呼吸强度,X为菌浓度
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况,因 为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳 的,有的进入代谢中间物分子,进入细胞或 产物,因此消耗的氧并不等于排出的二氧化 碳,此外,含氧的有机物降解后会产生二氧 化碳,使排气二氧化碳大于消耗的氧。
CER表示单位体积发酵液单位时间内释 放的二氧化碳的量 呼吸熵
CER RQ OUR
呼吸熵反映了氧的利用状况 RQ值随微生物菌种的不同,培养基成分的 不同,生长阶段的不同而不同。测定RQ值 一方面可以了解微生物代谢的状况,另一 方面也可以指导补料
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产 物,有意使菌体处于半饥饿状态,在营养限 制的条件下,维持产生次级代谢产物的速率 在较高水平。对于这种工艺,后期的补料控 制是关键。过程中发现,在补糖开始时,不 但CER、OUR大幅度提高,连RQ也提高约 10%,表明通过补糖不但提供了更多的碳 源,而且随着体系内葡萄糖浓度提高,糖代 谢相关酶活力也提高,产能增加。
1、研究方法 单因子实验:对实验中要考察的因子逐个 进行试验,寻找每个因子的最佳条件。一 般用摇瓶做实验 优点 一次可以进行多种条件的实验,可 以在较快时间内得到的结果。 缺点 如果考察的条件多,实验时间会 比较长 各因子之间可能会产生交互作用,影响的 结果准确性
数理统计学方法:运用统计学方法设计实验 和分析实验结果,得到最佳的实验条件。如 正交设计、均匀设计、响应面设计。 优点 同时进行多因子试验。用少量的实 验,经过数理分析得到单因子实验同样的结 果,甚至更准确,大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高,因为 实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的, 如果实验中存在较大的误差就会得出错误的 结果。
间接参数:将直接参数经过计算得到的 参数,如摄氧率、KLa(氧传递系数)等
直接参数又可分为在线检测参数和离线 检测参数 在线检测参数指不经取样直接从发酵罐 上安装的仪表上得到的参数,如温度、 pH、搅拌转速; 离线检测参数指取出样后测定得到的参 数,如残糖、NH2-N、菌体浓度。
一
发酵过程主要分析的项目
对式(1)积分得: 若μ 为常数,则:
此式可在△t=td (td为倍增时间)时求得, td即在 时所需时间,于是td=ln2/μ =0.693/μ 。 为比生长速率,单位是 h-1。
例题:某微生物的
=0.125 h-1,求td。
微生物生长分为:迟滞期、对数生长 期、稳定期和死亡期 在迟滞期,菌体没有分裂只有生长, 因为当菌种接种入一个新的环境,细 胞内的核酸、酶等稀释,这时细胞不 能分裂。 当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度 达到一定程度,细胞开始分裂,这时细 胞生长很快,比生长速率几近常数。这 个时期称为对数生长期
2、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液, 以克服营养不足而导致的发酵过早结 束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液 的取出,所以发酵结束时发酵液体积 比发酵开始时有所增加。在工厂的实 际生产中采用这种方法很多。
补料分批培养的优缺点 优点 在这样一种系统中可以维持低的 基质浓度,避免快速利用碳源的阻遏效应; 可以通过补料控制达到最佳的生长和产物 合成条件;还可以利用计算机控制合理的 补料速率,稳定最佳生产工艺。 缺点 由于没有物料取出,产物的积累最 终导致比生产速率的下降。由于有物料的 加入增加了染菌机会
类似重量单位:规定抗生素的某种盐 1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸 盐定义为1μg=1u 特殊单位:药检所制定某些抗生素的单 位 制霉菌素 1mg=3700u 多粘菌素B 1mg=10000u
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响 如菌本身的遗传特性、物质运输、能量 平衡、工程因素、环境因素等等。因此 发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程,本章首先 要告诉大家分析发酵过程的基本方面, 在此基础上再举一些例子,说明如何综 合分析发酵过程及进行优化放大。
三
发酵过程研究的方法和层次
5、磷含量 微生物体内磷含量较高,培养基中以磷酸盐为 主,发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。 磷是核酸的组成部分,是高能化合物ATP的组 成部分,磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基 中具有非常重要的作用,如果磷缺乏就要采取 补磷措施。
6、菌浓度和菌形态
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菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌形态 显微镜观察
随着细胞生长,培养液中的营养物减 少,废物积累,导致细胞生长速率下 降,进入减速期和稳定期。最后当细 胞死亡速率大于生成速率,进入死亡 期 对于初级代谢产物,在对数生长期初 期就开始合成并积累,而次级代谢产 物则在对数生长期后期和稳定期大量 合成。
分批培养的优缺点 优点 操作简单,周期短,染菌机会少, 生产过程和产品质量容易掌握 缺点 产率低,不适于测定动力学数据
微生物代谢是一个复杂的系统,它的 代谢呈网络形式,比如糖代谢产生的 中间物可能用作合成菌体的前体,可 能用作合成产物的前体,也可能合成 副产物,而这些前体有可能流向不同 的反应方向,环境条件的差异会引发 代谢朝不同的方向进行。
因此对发酵过程的了解不能机械的, 割裂的去认识,而要从细胞代谢水平 和反应工程水平全面的认识 微生物的生长与产物合成有密切相关性, 不仅表现在菌体量的大小影响产物量的 多少,而且菌体生长正常与否,即前期 的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。 特别是对于次级代谢产物的合成更具有 复杂性
第一节 发酵过程工艺控制的 目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类 分批培养
补料分批培养
半连续培养
连续培养
1、 分批发酵 简单的过程,培养基中接入菌 种以后,没有物料的加入和取出,除 了空气的通入和排气。整个过程中菌 的浓度、营养成分的浓度和产物浓度 等参数都随时间变化。
分批培养中微生物的生长
鸟苷发酵过程曲线
生产规模放大: 在大型发酵罐规模进行试验。将小型发 酵罐的优化条件在大型反应器上得以实 现,达到产业化的实现。 一般来说微生物在不同体积的反应器中 的生长速率是不同的,原因可能是,罐 的深度造成氧的溶解度、空气停留时间 和分布不同,剪切力不同,灭菌时营养 成分破坏程度不同所致。
第二节
发酵过程的中间分析
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛, 它显示了发酵过程中微生物的主要代谢 变化。因为微生物个体极微小,肉眼无 法看见,要了解它的代谢状况,只能从 分析一些参数来判断,所以说中间分析 是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数,因为它 们反映发酵过程中菌的生理代谢状况, 如pH,溶氧,尾气氧,尾气二氧化碳, 粘度,菌浓度等
二
发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌 种生长的最佳条件,使菌种的潜能发 挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大 的生产率
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸 强度、营养要求(酶系统)、代谢速率
菌代谢与环境的相关性 温度、pH、 渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力 等
4、氨基氮和氨氮
氨基氮指有机氮中的氮(NH2-N),单位是 mg/100ml。 如氨基酸中的氮,黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。 氨氮指无机氨中的氮(NH3-N)。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况,含氮产物合成情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过 量铵离子的抑制,因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和 氨氮的分析可控制发酵过程,适时采取补氨措施。 发酵后期氨基氮回升,这时就要放罐,否则影响提取过程。
二
(一)
产物量的测定
产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示 抗生素效价表示抗生素的有效成分的 多少,效价大小用单位(U)来表示 效价表示方法:重量折算法 重量单位
类似重量单位
特殊单位
重量折算单位:以最低抑菌浓度为 一个单位,如青霉素0.6微克=1U
重量单位:规定某些抗生素活性部 分1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、 红霉素等定义活性部分1μg=1u