内毒素实验凝胶法

鲎试剂灵敏度复核试验

取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，
其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶
液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入
0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放 入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。
原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素
C因子 活化的C因子
B因子
凝固酶原
活化的B因子
凝固酶 凝固蛋白原 鲎凝血系统－酶联反应 凝胶
二、细菌内毒素凝胶法
实验程序
1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品内毒素限量检查
凝胶法中用到的仪器
1. 超净工作台

凝胶法中用到的仪器

2. 恒温培养箱

孵育样品浸提液以及培养试验结果。
凝胶法中用到的仪器

3.干烤箱

用于实验用耐高温器皿的去热源，温度范围要求至少300℃
凝胶法中用到的仪器
4.
移液器和无热源的移液尖（或者去热源的 刻度吸管）

5. 计时器、漩涡混合器、电子天平等

4）75％乙醇
鲎试剂灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何
可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度
复核试验。
鲎试剂灵敏度复核试验

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒
素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡
混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和
0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均 应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可
能存在的外源性内毒素。

耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180℃
干烤至少2h或者250℃干烤至少30分钟； 塑料器皿置于30％双氧水中浸泡4h，再用细 菌内毒素检查用水充分冲洗，60℃烘干备用。

细菌内毒素的单位
内毒素的量值： 1、内毒素单位（EU） 1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定 为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。

注意事项

5. 冻干的鲎试剂应存放在2-8℃下；避免长时间放 置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间 歇使用过程中最好放在2-8℃的冰箱里，可存放24 小时，在-20℃以下，可存放四个星期，鲎试剂只 能冻融一次。
三、操作注意事项
试验前准备：
1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、 清洗操作方便。 洗净 去污去内毒素 去洗涤剂 精洗 除外源性热原：250 ℃干烤至少1小时。 2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水 冲洗后250 ℃干烤至少1小时。 3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管； 塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。

实验步骤
样品处理方法： a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器 具内腔，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提 液进行试验； b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加 入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（37±1）℃恒温箱 中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。 制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的 PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家 提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。
寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等 症状。 热原：任何可以导致肌体发热的物质。 机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。
外源性 热原质 吞噬性 白细胞 内源性 热原质
新蛋白 合成 新mRNA 翻译
体温调节 中心
发 热
1942年，美国药典首次收载热原检查法，中
国药典自第一版（1953年版）起收载。 所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都 要经过热原检查。 热原检查法的局限性： 1、重现性差。 2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。 3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。 4、非定量反应。 虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内 毒素是最主要的热原物质。

1、致热性。 2、致死性毒性。 3、白细
胞减少。 4、激活凝血系统。 5、降低血压，
休克。 6、 Shwartzman反应。 7、刺激淋
巴细胞有丝分裂，等等 。
细菌内毒素的耐热性

细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌
不能去除细菌内毒素，需250℃至少30分钟以上的
干热灭菌才能使其灭活 。
实验用器具的处理
2、国际单位（IU） WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品， 其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且 明确1IU＝1EU。
细菌内毒素检查法
wk.baidu.com方法 分类 凝胶法 浊度法
光度法
显色基质法 方法 特点
重现性好 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间
细菌内毒素检查法概念
结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶
缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不 能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。 其他：试剂购买。
谢
谢
细胞壁结构：
脂蛋白 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖 细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中 的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整 时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多 糖脱落才显示出内毒素活性。 脂多糖结构：多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A
致热活性部分
肽聚糖
细菌内毒素的生物活性
内毒素分子在水溶液中的状态
振荡前
振荡后
3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉 使用。 4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入， 避免产生气泡。 5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实 验结果，故操作应尽量熟练、快速。 6、恒温器的温度变化应<1℃，鲎试剂与样品混 匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在 60±2min，保温期间不得移动试管架，桌面保 持平稳，周围不能有振颤因素。 7、使用的试管为10mm×75mm，10为试管外径。
鲎试剂灵敏度复核试验


结果观察
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管 内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或 形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。

保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
鲎试剂灵敏度复核试验
若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。 计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵 敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最 后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方 可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批 鲎试剂的灵敏度。

凝胶法的试验步骤

下面我们结合中国药典2010、 GB 14233.2医
用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810
一次性无菌注射器 来学习具体试验方法。
实验步骤

浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：
V－－浸提介质体积，单位为（ml）； L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的 细菌内毒素的量），单位为EU/件； λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。

本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产生的细菌 内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的 一种方法 。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法， 由于凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同
试验方法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法为准，
所以凝胶法被广泛应用。
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节
肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及 两广的沿海一带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解
液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种 细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成 特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程 度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的 敏感试剂。
凝胶法概念

凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的
实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进
行，保证环境温度、湿度及通风稳定。 实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75％酒 精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存； 工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完， 不再保存。 2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振 荡器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步 均应在漩涡混合器上混匀30s。


实验步骤
结果观察
B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转 180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体， 不滑落。 而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管， 必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可 信的。最后看A溶液的反应情况： 阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不 合格； 阴性就说明小于20EU,结果是合格的； 1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶 液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断 合格；否则判断为不合格。
注意事项
1. 每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的 复核试验； 2. 安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环 易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用 镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均 应准确，缓缓加入避免气泡。 4. 保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶 受到振动后变形而误判为阴性。
凝胶法中用到的器皿
器具分类 反应试管 器具名称 玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、小三角 瓶或磨口瓶
移液器具
其他
刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、 记号笔
凝胶法中用到的试剂


1）鲎试剂：具有国家颁发的批准文号
2）细菌内毒素工作品 3）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于0.015EU/ml 的无菌水）
细菌内毒素检查法 （凝胶法）
苏州大学 卫生与环境技术研究所
内
基本概念
实验方法 操作注意事项
容
细菌内毒素

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主
要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放
出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。
一、概念及相关知识
热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、