发酵蔗渣产黄腐酸菌种的筛选及应用_赵莹

ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｓｔｒａｉｎ－Ｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ １６ｓＤＮＡ．Ｔｈｅ ＦＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｉｎ
ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｂａｇａｓｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ １７．２％ ｔｈａｔ ｗａｓ ２０％ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＦＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＫ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉａｌ（１４．３％）．
ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｆｏｒ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｔｒｉａｌ ｏｎ ｂａｇａｓｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｏｓｅ，ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｕｌｖｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ
（２） 发酵蔗渣产黄腐酸菌种的复筛。将初筛菌 种接种 于 种 子 锥 形 瓶 （３００ ｍＬ／５００ ｍＬ） 培 养 基 中， 置 于 培 养 温 度 ３０℃、 旋 转 式 摇 床 ２００ ｒ·ｍｉｎ－１下培养 ２４ｈ， 后 分 别 以 １０％ 的 接 种 量 接 种到工厂的蔗渣发酵培养基中，各菌种接种的物料 分装６个试验 袋 （２０ｃｍ×３０ｃｍ），每 袋 装 蔗 渣 等 物料约５００ｇ。将６ 个 试 验 袋 分 别 放 置 工 厂 发 酵 池 的上、中、下层 （每层２袋） 进行发酵，测定发酵 ６ｄ时各菌种产 ＦＡ 的 能 力。 以 工 厂 原 始 发 酵 模 式 为对照，以 ＦＡ 产率为主要指标筛选优良的发酵菌 种。并将高产 ＦＡ 的菌种用于生产性装袋 ３０ｋｇ 的 大物料发酵，从而确定其发酵蔗渣产 ＦＡ 的效能。 １．２．４ 高产 ＦＡ 菌种的分 子 生 物 学 鉴 定 ［１２－１３］ 将 筛选的高 产 ＦＡ 菌 种 进 行 培 养， 对 培 养 液 进 行 预 处理，并 用 ＴａＫａＲａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ３．０ 试 剂 盒 提 取 基 因 组 ＤＮＡ， 后用１．０％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测， 提 取 的 基 因 组 ＤＮＡ 置 于 －２０℃ 保 存 备 用。 将 Ｅ 菌 株 的 基 因 组 ＤＮＡ 用细菌的通用引物进行１６ＳｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩 增。ＰＣＲ 产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测， 后将 样品送 往 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 测序。 １．２．５ 测定方法 黄腐酸 （ＦＡ） 测定采用重铬酸 钾 氧 化 法 。 ［１４－１５］ １．２．６ 黄 腐 酸 增 长 量 与 增 长 率 的 计 算 公 式
结果表明腐植酸分离样品中芽孢杆菌占绝对优势，其中芽孢杆菌 Ｅ菌株具有较高的转化蔗渣产黄腐酸的能力。
该菌株经１６ｓＤＮＡ 鉴定为枯草芽孢杆菌。采用枯草芽 孢 菌 株 进 行 发 酵 蔗 渣 中 试 ，获 得 黄 腐 酸 含 量 为 １７．２％， 较
工厂对照组黄腐酸含量 （１４．３％） 提高了２０％ 。
福建农业学报 ２７（８）：８８３～８８７，２０１２
Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１２）０８－８８３－０５
赵莹，邱宏端，谢航，等．发酵蔗渣产黄腐酸菌种的筛选及应用 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１２，２７ （８）：８８３－８８７． ＺＨＡＯ Ｙ，ＱＩＵ Ｈ－Ｄ，ＸＩＥ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ Ｂａｇａｓｓｅ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｆｕｌｖｉｃ Ａｃｉｄ［Ｊ］． Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２７ （８）：８８３－８８７．
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｌｖｉｃ ａｃｉｄ （ＦＡ）ｆｒｏｍ ｂａｇａｓｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｓｔｒａｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｂｉｏｈｕｍｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｔ ｈｉｇｈ
发酵蔗渣产黄腐酸菌种的筛选及应用
赵 莹１， 邱 宏 端１， 谢 航１， 李 瑞 波２， 叶 汶 坤１
（１．福 州 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 福 建 福 州 ３５０１０８；２． 漳 州 市 诏 安 县 绿 洲 生 化 有 限 公 司 ， 福 建 漳 州 ３６３５０ห้องสมุดไป่ตู้）
１ 材料与方法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌 种 分 离 来 源 生 物 腐 植 酸 产 品， 由 漳 州 市诏安绿洲生化有限公司提供。 １．１．２ 培养基 细 菌 分 离 培 养 基 与 种 子 摇 瓶 培 养 基：牛肉膏 蛋 白 胨 培 养 基 ； ［１１］ 霉 菌 分 离 培 养 基 与 种子 摇 瓶 培 养 基： 查 氏 培 养 基 ； ［１１］ 纤 维 素 降 解 菌筛选培 养 基： （ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ，ＮａＣｌ １ｇ，琼 脂 ２０ｇ， 羧 甲基 纤 维 素 钠 （ＣＭＣ－Ｎａ）１５～２０ ｇ， 水 １ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２，１２１℃蒸汽灭菌 ２０ ｍｉｎ； 工 厂 发酵培养基： 蔗 渣 ∶ 麸 皮 为 ２∶１， 并 添 加 少 量 尿 素、ＮａＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４等成分。配料时将所 有 原 料 加 水混合均匀，物料水分控制以手捏混合料能成块， 指尖有水渗出但不滴落为宜。 １．２ 方 法 １．２．１ 腐植酸样品 中 微 生 物 的 分 离 纯 化 分 别 称 取３份生物 腐 植 酸 样 品 （１０ｇ· 份－１）， 做 ３ 个 样 品处理组试 验。其 中 第 １ 份 物 料 样 品 不 做 任 何 处 理，第２份物料 置 于 ６０℃ 下 烘 ３０ ｍｉｎ， 第 ３ 份 物 料样品添加５０ｍｇ多粘菌素 Ｂ。后将３种不同处理 的样品分别放入盛有１００ ｍＬ 无菌水并 带 有 玻 璃 珠 的锥形瓶 （２５０ｍＬ） 中， 振 摇 １０～２０ ｍｉｎ 后， 分 别吸取菌液进行 １０ 倍 梯 度 法 稀 释， 并 取 适 宜 稀 释 度的液体分别涂布于细菌分离培养基和霉菌分离培 养基平板。其 中， 细 菌 培 养 基 倒 置 于 ３７℃ 恒 温 箱 中培养１～２ｄ， 霉 菌 培 养 基 倒 置 于 ３０℃ 恒 温 箱 中 培养３～４ｄ。挑取 平 板 上 形 态 特 征 不 同 的 单 菌 落， 进一步进行分离纯化，后将纯化的单菌落转接于斜 面 培 养 ， 并 置 于 冰 箱 ４℃ 条 件 下 保 存 。 １．２．２ 分离菌种的 耐 高 温 纤 维 素 降 解 性 能 筛 选 将初步分离出的单一菌种接入牛肉膏蛋白胨培养基 或查氏培 养 基 上， 置 于 ４５℃ 下 培 养， 比 较 不 同 菌 种的生长情 况。 后 将 能 在 ４５℃ 下 良 好 生 长 的 菌 种
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｏ ｂａｇａｓｓｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ １６ｓＤＮＡ，ｔｈｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ
摘 要：为提高蔗渣发酵产黄腐酸的能力，从生物腐植酸样品中分离培养菌种，对分离获得的菌种进行较高温
下降解纤维素能力的测定，初步筛选出生长良好和降解纤维素能力较强的菌株，鉴别其形态、并接种于蔗渣物
料发酵试验进一步筛选，最后将优 化 筛 选 的 菌 株 进 行 １６ｓＤＮＡ 鉴 定， 同 时 应 用 于 工 厂 生 产 性 装 袋 的 中 试 发 酵。
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０１０８，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｏａｓｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ Ｌｔｄ．，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３６３５００，Ｃｈｉｎａ）
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂａｇａｓｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｆｕｌｖｉｃ ａｃｉｄ；ｓｔｒａｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
腐植酸 （Ｈｕｍｉｃ Ａｃｉｄ，简写 ＨＡ） 是一类广泛 存在于土壤、褐煤、泥炭、风化煤、河流、湖泊、 海洋和沼泽 中 天 然 有 机 物 的 总 称 ， ［１］ 是 有 机 物 质 经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分 子有机物，它具有优良的物理性质和化学性质，且 含有多种氨基酸和有益 微 生 物 种 群 ， ［１－２］ 已 广 泛 应 用于 工 业、 农 业、 医 学、 环 境 保 护 等 各 个 方 面 。 ［３－４］ 利用 工 农 业 废 物 资 源 研 制 的 生 物 腐 植 酸 （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍｉｃ Ａｃｉｄ， 简 称 ＢＨＡ） 有 别 于
接种到纤维 素 培 养 基 上， 筛 选 出 能 在 ４５℃ 下 生 长 并能降解纤维素的菌种。 １．２．３ 发 酵 蔗 渣 产 黄 腐 酸 菌 株 的 优 化
（１） 发酵蔗渣产黄腐酸菌种的初筛。将筛选出 的能在４５℃下 生 长 并 能 降 解 纤 维 素 的 菌 种 分 别 接 入 液 体 培 养 基 中 活 化 ， 置 于 ２００ｒ·ｍｉｎ－１、３０℃ 下 培养约３６ｈ。将 活 化 后 的 各 单 一 菌 种 以 １０％ 的 接 种量分别 接 种 于 不 灭 菌 的 发 酵 培 养 基 中 （蔗 渣 约 ８０ｇ·瓶－１）， 并 置 于 工 厂 车 间 的 发 酵 池 环 境 发 酵 ６～７ｄ。以工厂原始发酵模式数据作为对照， 通过 比较试验瓶发酵初期与发酵后物料中黄腐酸含量的 差异，选出黄腐酸含量增加较多的菌种进行复筛。
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福建农业学报
第 ２７ 卷
品 。 ［７－８］ 国内生物腐植酸的研 究 与 生 产 还 处 于 初 级 阶段，其研究方面也多以应用为主，生物腐植酸发 酵主要是人工堆建发酵法，存在着产量较低、产品 质量不稳定、机械化程度较低，生产的生物腐植酸 农用产品 中 含 有 益 菌 数 量 也 较 低 等 ［９－１０］ 不 足。 为 此，进行发酵蔗渣产黄腐酸菌种的筛选及应用具有 重要的意义。本试验以漳州市诏安绿洲生化有限公 司自主研制的生物腐植酸样品为基础，分离筛选其 发酵蔗渣产黄腐酸较高效的菌种，为提升与促进我 国生物腐植酸发酵产业的发展提供理论基础。
传统的 腐 植 酸 产 品 ， ［５－６］ 它 是 由 作 物 秸 秆、 木 屑、 蔗渣等农业废弃物通过微生物发酵工艺制取，是农 用资源化和功能化的一个重要渠道，其重要成分为 腐植 酸 中 最 具 活 性 的 黄 腐 酸 （Ｆｕｌｖｉｃ Ａｃｉｄ， 简 称 ＦＡ）。因此，ＢＨＡ 开拓 了 将 废 弃 物 转 化 为 极 有 价 值的新资源和一条农业资源综合利用的新路，已成 为学科交叉的研究前沿和企业产品升级换代的重要 方向。
关键词：蔗渣发酵；黄腐酸；菌种筛选；应用
中 图 分 类 号 ：Ｑ ９３９．９
文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ Ｂａｇａｓｓｅ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｆｕｌｖｉｃ Ａｃｉｄ
ＺＨＡＯ Ｙｉｎｇ１，ＱＩＵ Ｈｏｎｇ－ｄｕａｎ１，ＸＩＥ Ｈａｎｇ１，ＬＩ Ｒｕｉ－ｂｏ２，ＹＥ Ｗｅｎ－ｋｕｎ１
目前，国外还没有生物腐植酸的生产企业和产
收 稿 日 期 ：２０１２－０３－３０ 初 稿 ；２０１２－０７－０６ 修 改 稿 作者简介：赵莹 （１９８４－），女，硕士，研究方向：应用微生物及代谢工程 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｙｓｗｋ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ） 通讯作者：邱宏端 （１９５５－），女，教授，主要从事应用微生物研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｕｈｏｎｇｄｕａｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ） 基金项目：福建省发改委重点项目 （２００７－６２３）