第九章新型生物制药技术

特点
双链RNA（如siRNA ）作用强烈； 与核酶连接作用更强。
核酶（Ribozyme)
核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年 Cech在嗜热四膜虫中首先发现。
目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种 1. 发卡状核酶 2. 锤头状核酶 3. Ⅰ型内含子核酶 4. RNaseP核酶 5. 丁型肝炎病毒核酶
核酸药物的修饰和给药
增强核酸药物有效运送到靶组织的方式：
Ⅰ 用脂质体等材料包埋核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加 入有助于膜融合的分子如氯喹，可以进一步提高它们进入细胞的效 率
Ⅱ 在核酸分子上连接一段可以进入细胞的肽段即转导肽 不同的应用目的应采用不同的给药方式：局部注射、静脉注射， 有报道表明核酸药物还可以通过皮肤给药
美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药 物并进行了临床实验。
RNA干扰药物
RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广
泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。
RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：
执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时， RISC 就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从 而抑制目标基因的表达
启动阶段原理图
启动阶段
Dicer
siRNA
（21-23bp）
RISC前体
RISC
执行阶段原理图
执行阶段
mRNA
RISC 切割
AAAAAAA
AAAAAAA
新型生物制药技术
苟兴华
第一节 核酸药物及其制药技术
反义核酸（Antisense nucleic acid)和核酶 (Ribozyme)
RNA干扰 (RNAi)药物 核酸药物的修饰和给药 DNA疫苗 (DNA vaccine)技术
反义核酸
反义RNA分子 ： 可以和目标基因的mRNA互补的
一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能； 反
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
siRNA的设计和制备
siRNA的设计 应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细 胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标 基因的序列设计siRNA
Tom Tuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则： 选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义链
天然锤头状核酶示意图
5′
底物位点 CCUGUCACCGGA U
G
U
G
3′ GGACA UGGCCU
A CU
UUU
A
G
G C
GA G
A U
AU
催化活性位点
GC
GC AG
UU
反义核苷酸药物的应用
反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一 些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。
1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治 疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。
义 反义DNA分子： 类似于反义RNA分子，可以抑制基
核 酸
因表达的分子；
RNA-DNA嵌合分子：
经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo
作用机理
与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟 与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译 与mRNA形成dsRNA，诱导RNase H对其降解
与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物， 影响DNA复制
Ⅰ启动阶段 Ⅱ执行阶段
RNAi的作用原理
启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞Fra Baidu bibliotek中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解 成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白 形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”
（RNA-induced silencing complex，RISC）
核酸药物的修饰和给药
人体内存在大量的核酸酶，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核 酸药物治疗时，一个关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降 解并被有效地运输到靶细胞。RNA的化学修饰是一个有效的途径
化 修饰磷酸二酯键
学 修
修饰核酸
饰
修饰骨架
邓子新《Nature Chemical Biology》 2007.
DNA疫苗
不同于传统的蛋白质疫苗，DNA疫苗是通过基因重组技术把编码抗 原蛋白的基因序列克隆到质粒，并在基因的上游加上细胞可以识别 的启动子，形成一个表达载体。将这个表达载体DNA直接导入宿主 细胞，由细胞的基因转录、转译系统直接合成抗原蛋白，诱导宿主 产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到防病治病目的
DNA疫苗原理
DNA疫苗较传统蛋白疫苗的优点
的第1，2个核苷酸，GC比为50﹪左右，同时在正义链和反义链
的3′-都有TT两个核苷酸的突变
siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌 体外转录
体T7、SP6等启动子的表达质粒
正义链 反义链
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基 团增加siRNA的稳定性
胞内其它
核酸酶切割
siRNA药物
长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞 的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双 链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活 RISC，发挥抑制基因表达的作用。
siRNA的作用 体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙
肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。 siRNA还可以治疗一些非感染性疾病：美国正在开发一种治疗老
年性黄斑变性的siRNA药物
siRNA药物优点与缺点
优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一 性强 与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确， 效果更加肯定
缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因 此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使 效果大打折扣 在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株
siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌
体T7、SP6等启动子的表达质粒
体外转录
正义链 反义链