浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究

浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究

浓香型白酒窖泥中栖息着大量可培养及不可培养的微生物,而这些微生物群落组成及多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。此外,专性厌氧梭菌纲微生物及产己酸微生物一直被认为是窖泥中的重要功能菌群。

然而,关于窖泥质量与微生物群落之间的关联性及上述功能微生物群落多样性解析的系统研究尚无报道。因此,全面剖析窖泥中功能微生物菌群组成及多样性、窖泥质量与微生物群落之间的关联性为深入认识浓香型白酒生产机制,进而为从根本上提升浓香型白酒品质提供理论依据。

同时也是带动浓香型白酒传统生产技术升级及实现浓香型白酒可持续发展的必要环节。本课题以浓香型白酒窖泥为研究对象,围绕目前微生物学研究的核心问题——微生物群落组成及多样性解析、微生物之间相关性和功能微生物确定开展相关研究。

采用了传统可培养技术及多种分子生态学技术并建立和开发了相应的新方法及策略,定性及定量研究了窖泥中功能微生物菌群组成及不同质量等级窖泥样品中微生物群落组成。合理运用了多种生物信息学方法,揭示了窖泥质量与微生物群落之间、理化因子与微生物群落之间、微生物群落成员之间的相关性。

本论文主要研究结果如下:(1)针对16S r RNA基因V4可变区,采用Illumina Miseq高通量测序技术对不同质量窖泥样品中原核微生物群落多样性进行解析。在不同分类水平中共检测到33个门、145个目及225个属的原核微生物。

微生物群落α-多样性分析结果表明,微生物群落的Shannon多样性指数及Chao1丰度指数随着窖泥质量提高呈现显著增加趋势。β-多样性解析结果表明窖泥质量与其微生物群落组成呈现明显相关性。

随着窖泥质量提高,优势原核微生物群落组成从单一的Firmicutes逐渐变为Firmicutes、Euryarchaeota和Bacteroidetes三个门;窖泥中核心属数目从2个属增加15属,主要集中于Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Methanomicrobia四个纲,尤其是Clostridia(7个属)。(2)基于Spearman’s相关性的网络分析结果表明窖泥微生物之间的同现性主要集中在不同门的微生物之间,尤其是Firmicutes、Euryarchaeota、Bacteroidetes及Proteobacteria 四个门之间。

同现性网络图谱中约77%hubs属于Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria及Methanomicrobia四个纲且主要存在于优质和正常窖泥样品中,推测其对正常和优质窖泥生态体系的稳定起着重要作用。负相关网络图谱中共发现3个hubs均为乳酸菌(Lactobacillus,Pediococcus和Streptococcus)且主要分布于退化窖泥样品中,与同现性网络图谱中的11个hubs呈现显著负相关作用,推测乳酸菌一旦成为优势菌群将导致正常及优质窖泥中正相关hubs的种类及含量逐渐减少甚至消失,进而导致窖泥微生物群落结构不稳定及窖泥质量退化。

此外,p H作为整合的理化参数与窖泥微生物群落多样性之间相关性最高,多样性(Shannon)指数从酸性环境到近中性环境时迅速增加然后稳定。冗余分析(RDA)结果表明窖泥理化因子中的水溶性有机碳(DOC)、铵根离子(NH4+)、p H、有效磷(AP)及乳酸显著影响窖泥微生物群落结构(p<0.01),其中DOC对窖泥微生物群落结构影响最大;而总氮(TN)含量及含水量对窖泥微生物群落影响不显著。

(3)建立了从复杂菌群中快速解析梭菌纲微生物菌群组成及多样性的方法,

其核心环节是梭菌纲微生物通用性及特异性引物设计。基于核糖体数据库项目(RDP)数据库中16S r RNA基因序列设计了梭菌特异性及通用性引物对(SJ-F和SJ-R),其扩增区域为原核微生物16S r RNA基因序列的V4和V5可变区。

理论验证结果表明梭菌引物98.6%的扩增子属于梭菌纲且对梭菌纲中的19个科及unclassified_Clostridia均有不同程度的扩增。结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,引物SJ-F/SJ-R能特异性解析复杂微生物菌群体系(选取窖泥为代表)中梭菌菌群多样性,并检测到7个系统发育簇中的梭菌种属。

相比于细菌通用引物P3/P2,引物SJ-F/SJ-R对窖泥梭菌菌群组成及多样性解析更为灵敏、准确。该方法可以推广至自然环境及其它厌氧发酵体系中梭菌菌群组成及多样性解析和梭菌菌群动态变化监控的研究。

(4)采用Illumina Miseq高通量测序技术结合梭菌特异性引物SJ-F/SJ-R 解析不同年份窖泥样品中梭菌群落多样性。共检测到20个梭菌纲中的科及40个梭菌纲中的属,其中12个科及21个属在窖泥中未见报道。

系统发育分析将窖泥中主要梭菌可聚类为16个梭菌簇,在很大程度上丰富了人们对窖泥复杂微生态体系中大量未培养梭菌分类地位的认识。Clostridiaceae及Tissierellaceae两个目是所有窖泥样品中含量都很高的梭菌,而1年窖泥中Lachnospiraceae及Mogibacteriaceae相对含量高于其它年份的窖泥样品,相反地,Anaerobrancaceae及Eubacteriaceae在30年及以上的窖泥样品中含量高于1年窖泥。

实时荧光定量PCR分析结果表明老窖(30年及30年以上)窖泥样品中梭菌菌群的含量(2.06×108-1.62×109 16S r RNA gene copies·g-1窖泥)比其在新窖(1年)窖泥中含量要高1-2个数量级。(5)通过差异性解析可培养技术及未培

养技术得到的微生物信息与相应挥发性代谢物含量确定了Clostridium kluyveri为不同时空窖泥中的高产己酸梭菌。

代表菌株C.kluyveri N6所产挥发性代谢物包括脂肪酸类化合物:己酸、辛酸及丁酸;醇类化合物:1-丁醇、1-己醇及1-辛醇及乙酯类化合物:丁酸乙酯、己酸乙酯及辛酸乙酯。丁酸、己酸、辛酸及其相应的乙酯。