10(1).基因功能的研究方法

5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）
2.1 插入序列(insertion sequence, IS)
仅含有转座酶基因的简单转移序列。长度 多在700－1500bp左右。 由末端反向重复序列 (IR)，转座酶基因组成。插入基因组中时，在 靶位上生成正向重复序列(DR) 常见的IS结构 。

IS IS1 源自文库S2 IS4 IS5 IS10 IS50
通过上述种种方法得到的携带失活基因的品系与 个体后，下一步工作就是检测突变体表型以便指 认未知基因的具体功能。这一步也会遇到难题， 生物表型范畴很广。 即使单细胞的酵母，要确认一个未知基因对表型 的贡献，也可列出很长的一串名单。
至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 合性，区分其准确的功能更加棘手。
有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
③ 治疗遗传病 这包括去除多余基因或修饰改造原有异 常基因以达到治疗的目的。 ③ 改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物 学史上的一个重大突破，而基因敲除技 术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。 这项新技术在基础理论研究及实际应用 中都将有着广阔的应用前景。
1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题
就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如 大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前 已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。 • 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
1．基因失活是功能分析的主要手段
传统的遗传分析主要借助突变型研究表型 变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学 试剂处理可使生物群体产生突变个体，也 可从自然的群体中发现突变体。 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这 一突变体是否与改变的表型对应。在此基 础上采用分子生物学方法进一步分离与克 隆目标基因。
转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编码 基因不能自我转座。这一表达载体转化细胞获
得的再生植株为Ａ（sAc）。
外显子捕获载体构建：在转座子的边界顺序与
标记基因之间插入内含子剪接受体顺序，将它
们转化细胞获得再生植株B。
③ 将植株Ａ和植株B杂交，在转座酶的作用下来自植
株B的转座子可以切离与转座。当它们插入到某一 外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读 框的mRNA。根据突变表型与标记基因的共分离 筛选转化无性系，通过自交可得到纯合的不含转 座酶基因的插入突变系。 ④ 增强子捕获载体将核心启动子TATA盒框与标记 基因编码顺序连接，然后在其两侧安装转座子边 界，转化细胞获得再生植株C。将植株A与植株C 杂交，在转座酶的作用下来自植株C的转座子可以 转移到增强子下游启动标记基因表达。采取类似4 的方法分离纯合的插入突变系，进一步检测增强 子的组织特异性表达场所。
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )
5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达 5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
1.3 基因敲除主要应用领域及国内外研究 进展
基因敲除的应用领域主要有： ①建立人类疾病的转基因动物模型，为医学 研究提供材料； ②改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功 能； ③治疗遗传病； ④改造生物、培育新的生物品种。
ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术 的成熟，首次使体外精细的基因操作与小 鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接 的结合，为探讨高等动物基因组结构和功 能提供了有效的方法。 由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对 哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、 癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗 传学产生了极大影响。 理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES 细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟 的基础上开展其它实验动物的基因敲除工 作。
目前应用的最成功的是玉米的Ac-Ds转座因 子系统。基因标签突变库的工作原理如下： 玉米色粒调控元件 Ac-Ds 系统：第9 染色体 C 基因：色素合成基因。 Ac 基因：自主移动的调节因子，4.5 kb， 5 个exon， 编码转座酶。 Ds 基因：非自主移动的受体因子， 0.5－ 4.0 kb，与Ac 有同源序列 ，插入引起色素 不能合成。
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或 其新功能，研究发育生物学
深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命 各期的表现，可以得到详细的有关该基因 在生长发育中的作用，为研究基因的功能 和生物效应提供模式。 例如，目前人类基因组研究多由新基因序 列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在 小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。 目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、 LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种 基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
1.2 基因敲除的技术路线如下： ① 构建重组基因载体； ② 用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA转入受体细胞核内； ③ 用选择培养基筛选已击中的细胞； ④ 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转 基因动物，对转基因动物进行形态观 察及分子生物学检测。
Note:
基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细
长度 末端IR 768 23 1327 41 1428 18 1195 16 1329 22 1531 9
靶位DR 9 95 （12） 4 9 9
插入选择 随机 热点 AAAN20TTT 热点 TNAGCN 热点
2.2 实验步骤
将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子
如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因； 2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。 3. 一致性常指同一位臵同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。 • 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。 • 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。 • 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； • 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。

① 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学 研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分 子基础及诊断治疗的重要实验材料。如 1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因 （CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立 了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为 CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以 顺利通过了基因治疗的动物试验；于1993 年开始临床试验并获得成功。
所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的 分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设 计从基因到表型的研究。如果我们能找到 某种方法，根据待测基因的顺序使生物体 内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型 变异。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的 表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2．转座子突变库构建
转座子标签法又称基因标签(gene tagging)， 通过构建插入突变库系统，分离与克隆功 能基因与调控顺序。这一策略主要依据以 下技术： 植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外 源基因在转基因植株中成功表达。
植物中有许多转座子系统，它们的转座机 制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。 转座子可以发生回复突变，从插入的座位 脱离，使突变系重现野生型表型。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。 • 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源 重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。 • 到1987年，Thompsson首次建立了完整的 ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年 中，基因敲除技术得到了进一步的发展和 完善。
胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于 高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列 自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来 是一件非常困难的工作。因此，同源重组的 筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的 关键问题。 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向 选择系统"适用范围宽且效率较高。
一、计算机预测基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之 前的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的 不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形 成之后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因 为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但 它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸 位臵是相同的。 • 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从 数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的 相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。