生物大分子的分离与制备2013文稿演示

– 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质 和奥秘：运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机 理。
17.03.2021
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生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过滤、离心、色谱）
– 分析： • 结构与性质（序列分析，X-射线晶体衍射，核磁共 振，波谱，质谱等） • 功能（实验设计与方法） • 代谢及其细胞调控 • 改造及利用
对其他生物分子的特殊亲和力。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间特异性的差异，如分子 的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、 极性、电荷和与其他分子的亲和性等。
1.动物组织： 选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的
脏器组织为原材料。单酯酶，从含量看，虽然在胰 脏、肝脏和脾脏中较丰如磷酸富，但是因其与磷酸 二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所 以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸 二酯酶的前列腺作材料。
• 生物化学研究技术：
– 分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、 离心、层析、电泳等；
– 分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技 术、分子标记等。
– 分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与 反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。
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生物化学研究技术方法
生物大分子的分离与制备2013文稿演示
生物大分子 的提取与制备
引
言
❖ 生物化学研究的三个主要发展阶段：
源自文库
– 叙述生物化学阶段（1770～1903 年）。又称为静态或形态生 物化学，研究内容以分析生物体内物质的化学组成、性质和含 量为主。
– 动态生物化学阶段（1903～1950 年）。又称为生理化学。主 要研究生物体内组成物质的化学变化及相互转变。
第一节：生物材料的选择
选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源 丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。
生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工生物 材料。
生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的 生物个体、器官或组织。
人工生物材料又分为三种： 1、 新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：
在水和各种有机溶剂中的溶解性。
在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。
固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带 电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、 在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定 性和对各种化学试剂的稳定性。
生物大分子相互作用分析技术:
1. 凝胶阻滞分析法 2. DNA酶Ⅰ足纹分析法 3. 蛋白质芯片 4. 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋
白质
第一章 生物大分子的分离纯化
➢ 蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。
➢ 蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、 物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等 多种生理功能；
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆
8. 基因组文库构建
9. cDNA文库构建
10. 文库筛选
11. 报告基因检测
12. 基因芯片
13. 基因敲除
14. RNAi
15. 转基因动物
生物大分子相互作用分析:
• 生化反应过程实际上是生物分子间的相互作 用过程。生物大分子间的相互作用是它们的 功能基础。随着分子生物学研究的进展，建 立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 术。
• 研究技术的选择：？？？
– 实验的目的：定性分析与定量分析； – 分离或分析物的物理化学性质； – 研究技术的精确性、准确性及检测限； – 研究成本； – 潜在的风险与危害。
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生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素 很多，实验方法经验性较强。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
确定要制备的生物大分子的目的和要求， 是进行科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制 备生物大分子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大 分子目的产物的物理化学性质。
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生物化学研究技术方法
❖经典的研究步骤：
– 分离生化组分（细胞
器和生物分子）；
– 分析生化组分的结构；
改 造
– 分析生化组分的功能
利 用
和代谢（合成与分解）
生命现象
分离
生化组分
分析
及其相互作用。
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1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控
生物化学研究技术方法
生物材料的破碎和预处理。
分离纯化方案的选择和探索，这是最困难 的过程。
生物大分子制备物的均一性（即纯度）的 鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电 泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一 个峰。
产物的浓缩，干燥和保存。
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则
生物组织→ →提取液→ →粗产品→
层析法
电泳法 超离心法
→结晶
透析和超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
• 分子大小 • 溶解度 • 电荷性质 • 吸附性质 • 生物亲和
注意事项
基本原则：防止生物分子变性、降解 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各 种蛋白质的合成。
生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比， 有下列几个特点：
• 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数 千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍 在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。
许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易 变变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制 备。