人工结合抗原制备(汇总).ppt
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半抗原的分子空间结构
最好有分支结构， 最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后 筛选。
︵。︵
13
人工抗原的质量评定
• 浓度测定
紫外吸收法、福林酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和 荧光法等。
• 纯度鉴定和结构分析
紫外光谱扫描法 电泳技术鉴定是否达到电泳纯
︵。︵
14
︵。︵
15
透析3 d
透析产物小
剂量分装， 于－20 ℃保 存备用
︵。︵
12
影响人工抗原质量的因素
偶联比（联接到蛋白质分子上的半抗原数目）
连接到蛋白分子上的半抗原数以5-20为宜，为了取得最佳免疫效果， 应逐个确定各种载体的最佳结合比。
偶联桥
结构简单，能量低，直链，有助于半抗原暴露在外面 最好3-6个直链的碳原子结构
结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。
• ①人工结合抗原：将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联， 或将无免疫原性的有机分子如二硝基苯（DNP）或三硝基苯（TNP） 与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属人工结合抗原。
• ②人工合成抗原：用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。 只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的 共同聚多肽（PLL）。
︵。︵
5
半抗原
选择合适的多肽序列，蛋白质的抗原决定簇 一般由6-12个氨基酸构成，呈连续性或者非 确定抗原性区域
连续性序列。
抗原决定簇大部分为亲水性基团，暴露在外 侧，抗原决定簇柔韧性比较高。
亲水性、表露性、 柔韧性
制备性抗原地多肽有效长度一般是10-20个 氨基； 334Da﹤ 半抗原的分子量﹤ 374Da 制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。 ﹤300Da 产生具有良好灵敏度和特异性单
︵。︵
7
蛋白偶联方法
通常是在条 件温和的水 溶液中将半 抗原与载体 蛋白共价结 合，不宜在 高温、低温、 强碱、强酸 条件下进行。
偶联剂 相对量
偶联剂 的有效 浓度
半抗原的 稳定性、 可溶性、 理化特性
偶联效果
缓冲液成 分及其纯 度和离子 强度、PH
偶联 物的 浓度
偶联物 相对比
例
一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。 所有的偶联 方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。
N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂
︵。︵
11
方法举例（EDC法实验步骤）
mTP 5 mg
cBSA 2.5 mg
EDC·HCl 79 mg 充分溶解于
250 μl TE buffer （pH 8.0）
37 ℃摇床中反应2 h
TE buffer （pH 8.0）
250 μl
Sephadex柱
0.5 ml 溶 液在PBS中
• ③基因工程抗原：将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当 载体（如细菌粒或病毒）DNA分子相结合，然后引入受体细胞中（如 原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞）使之表达， 即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后可做为疫苗，此即基因工程 疫苗。
︵。︵
4
人工结合抗原
半抗原 偶联桥
载体蛋白
︵。︵
8
蛋白偶联方法
• 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
• ①混合酸酐法（mixed anhydride method），又称氯甲酸异丁酯法
正丁胺
-COOH-
中间体+NH3+
+氯甲酸异丁酯
结合产物
• ②碳二亚胺法(EDC)
EDC
半抗原
载体蛋白
酰胺键 酰胺键
︵。︵
9
蛋白偶联方法
• 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
• ①戊二醛法 -N=C< （schiff键） • ②重氮化法 （用于活性基团是芳香胺基的半抗原）
芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮盐
︵。︵
10
蛋白偶联方法
• 含羟基半抗原的偶联
• ①琥珀酸酐法
-OH-+琥珀酸酐 无水吡啶 带有羧基的中间体 EDC法或混合酸酐法 结合产物
• ②羰基二咪唑法（CDI）
2
免疫原——具有免疫原性的物质
化学组成 大分子蛋白、多糖等
免疫原性的 化学基础
wk.baidu.com
分子量
﹥ 10000 具有免疫原性 ；4000 ﹤免疫原﹤
10000 呈弱免疫原性 ； 4000 ﹤ 一般不具 有免疫原性。
化学结构
一般而言，分子结构和空间结构愈复杂的物 质免疫原性愈强
︵。︵
3
人工抗原
• 人工抗原：用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学
半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激发人或动 物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全 抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物 质（ 如青霉素、磺胺剂等 ） ，称为简单半抗原。
载体蛋白：制作人工结合抗原时与半抗原进行偶联的具有免疫原性的生 物大分子，主要为大分子的蛋白质。如：牛血清白蛋白(BSA)。
人工结合抗原制备
20130805
︵。︵
1
• 抗原——是指能够刺激机体产生（特异性）免疫 应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞 在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的 物质。
• 抗原的基本特性： ①诱导免疫应答的能力，即免疫原性。 ②与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反
应性）。
︵。︵
克隆抗体的可能性下降。
确定多肽的长度
半抗原
︵。︵
6
人工抗原合成常用的载体
载体的 特点
载体表面应首先应具有化学活性基团。 载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子。 载体应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能。 载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。
牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、 人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等是常用 的载体蛋白。
最好有分支结构， 最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后 筛选。
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人工抗原的质量评定
• 浓度测定
紫外吸收法、福林酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和 荧光法等。
• 纯度鉴定和结构分析
紫外光谱扫描法 电泳技术鉴定是否达到电泳纯
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透析3 d
透析产物小
剂量分装， 于－20 ℃保 存备用
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影响人工抗原质量的因素
偶联比（联接到蛋白质分子上的半抗原数目）
连接到蛋白分子上的半抗原数以5-20为宜，为了取得最佳免疫效果， 应逐个确定各种载体的最佳结合比。
偶联桥
结构简单，能量低，直链，有助于半抗原暴露在外面 最好3-6个直链的碳原子结构
结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。
• ①人工结合抗原：将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联， 或将无免疫原性的有机分子如二硝基苯（DNP）或三硝基苯（TNP） 与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属人工结合抗原。
• ②人工合成抗原：用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。 只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的 共同聚多肽（PLL）。
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半抗原
选择合适的多肽序列，蛋白质的抗原决定簇 一般由6-12个氨基酸构成，呈连续性或者非 确定抗原性区域
连续性序列。
抗原决定簇大部分为亲水性基团，暴露在外 侧，抗原决定簇柔韧性比较高。
亲水性、表露性、 柔韧性
制备性抗原地多肽有效长度一般是10-20个 氨基； 334Da﹤ 半抗原的分子量﹤ 374Da 制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。 ﹤300Da 产生具有良好灵敏度和特异性单
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蛋白偶联方法
通常是在条 件温和的水 溶液中将半 抗原与载体 蛋白共价结 合，不宜在 高温、低温、 强碱、强酸 条件下进行。
偶联剂 相对量
偶联剂 的有效 浓度
半抗原的 稳定性、 可溶性、 理化特性
偶联效果
缓冲液成 分及其纯 度和离子 强度、PH
偶联 物的 浓度
偶联物 相对比
例
一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。 所有的偶联 方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。
N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂
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方法举例（EDC法实验步骤）
mTP 5 mg
cBSA 2.5 mg
EDC·HCl 79 mg 充分溶解于
250 μl TE buffer （pH 8.0）
37 ℃摇床中反应2 h
TE buffer （pH 8.0）
250 μl
Sephadex柱
0.5 ml 溶 液在PBS中
• ③基因工程抗原：将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当 载体（如细菌粒或病毒）DNA分子相结合，然后引入受体细胞中（如 原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞）使之表达， 即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后可做为疫苗，此即基因工程 疫苗。
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人工结合抗原
半抗原 偶联桥
载体蛋白
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蛋白偶联方法
• 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
• ①混合酸酐法（mixed anhydride method），又称氯甲酸异丁酯法
正丁胺
-COOH-
中间体+NH3+
+氯甲酸异丁酯
结合产物
• ②碳二亚胺法(EDC)
EDC
半抗原
载体蛋白
酰胺键 酰胺键
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蛋白偶联方法
• 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
• ①戊二醛法 -N=C< （schiff键） • ②重氮化法 （用于活性基团是芳香胺基的半抗原）
芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮盐
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蛋白偶联方法
• 含羟基半抗原的偶联
• ①琥珀酸酐法
-OH-+琥珀酸酐 无水吡啶 带有羧基的中间体 EDC法或混合酸酐法 结合产物
• ②羰基二咪唑法（CDI）
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免疫原——具有免疫原性的物质
化学组成 大分子蛋白、多糖等
免疫原性的 化学基础
wk.baidu.com
分子量
﹥ 10000 具有免疫原性 ；4000 ﹤免疫原﹤
10000 呈弱免疫原性 ； 4000 ﹤ 一般不具 有免疫原性。
化学结构
一般而言，分子结构和空间结构愈复杂的物 质免疫原性愈强
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人工抗原
• 人工抗原：用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学
半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激发人或动 物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全 抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物 质（ 如青霉素、磺胺剂等 ） ，称为简单半抗原。
载体蛋白：制作人工结合抗原时与半抗原进行偶联的具有免疫原性的生 物大分子，主要为大分子的蛋白质。如：牛血清白蛋白(BSA)。
人工结合抗原制备
20130805
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1
• 抗原——是指能够刺激机体产生（特异性）免疫 应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞 在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的 物质。
• 抗原的基本特性： ①诱导免疫应答的能力，即免疫原性。 ②与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反
应性）。
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克隆抗体的可能性下降。
确定多肽的长度
半抗原
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人工抗原合成常用的载体
载体的 特点
载体表面应首先应具有化学活性基团。 载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子。 载体应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能。 载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。
牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、 人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等是常用 的载体蛋白。