第七节 离子交换色谱

第七节离子交换色谱

离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。

20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交

换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。

一、离子交换色谱相关理论

(一)基本原理

离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。

图6.7-1 离子交换色谱原理

梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子；

待分离的目标分子；▲需除去的杂质

1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平

衡色谱柱，以备下次使用

蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。

(二)基本理论

1 . 离子交换作用

离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子)依靠静电引力能够吸附在其表面(如图6.7-2所示)。这样，各种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。

无机离子与交换剂的结合能力与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说，离子的价态越高，结合力越强；价态相同时，原子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，常见离子结合力强弱顺序为：

Li+

图6.7-2离子交换色潜中所进行的离子

交换过程(以阳离子交换树脂为例)

在阴离子交换剂上，结合力强弱顺序为：F—

目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上;洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。

2. pH和离子强度I的影响

pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。

pH决定了目标分子及离子交换剂的带电荷情况，因而是决定目的物是否发生吸附的最重要参数。分离时，应控制pH使得目标分子和离子交换剂带相反的电荷。一方面，离子交换剂有一个工作pH范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷；另一方面，溶液的pH直接决定了目标分子带电荷的种类和数量，选择适当的pH，能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同时如果pH距离目标分子等电点过远，则造成目标分子与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。

在选择操作pH时还需特别注意目标分子的pH稳定范围，若超出此范围会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。特别是要考虑到由于道南效应

( Donnan）的存在，离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的，离子交换剂是亲水的，其表面有一层水膜，水膜里可以看作是离子交换剂的微环境。在阳离子交换剂表面的微环境中，H+被阳离子交换基团吸引而OH—被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中低1个pH单位；而阴离子交换剂表面的微环境中，OH —被阴离子交换基团吸引而H+被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中高1

个pH单位。例如，某蛋白质在pH5时被阳离子交换剂吸附，实际上该蛋白质在交换剂表面是处在pH4的环境中，若此蛋白质在此pH条件下不稳定将会失活。大多数蛋白质在pH4以下稳定性都会下降而使回收率很低。

由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。低离子强度下，目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I逐渐升高时，目标分子逐渐被置换下来。绝大多数目的物在

1mol/L的盐浓度下能够被洗脱，因此在探索条件阶段，人们常把洗脱盐的终浓度定为1mo1/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物结构的角色，另外，不同离子从交换剂上将目的物置换下来的能力是不同的，并且离子类型还会对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序产生影响。

3. 疏水相互作用和氢键

虽然目的物与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。

疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时，例如离子交换树脂，特别是聚苯乙烯树脂，骨架带有较强的疏水性，能与目的物分子中的一些疏水性氨基酸残基之间通过疏水相互作用结合。现代HPLC中仍有部分色谱介质以树脂为骨架。氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以Sephadex或Sepharose为基质的离子交换剂，骨架糖链中的轻基、羧基等基团能够与目的物分子中带亲水侧链的氨基酸残基之间形成氢键。当目的物与杂质在电性质方面很接近时，这些额外的作用力在分离时起着决定性的作用，据此往往可实现分离。

4. 离子交换动力学

离子交换的发生及进行的程度即离了交换平衡取决于离子作用，而离子交换动力学则取决于离子交换剂的颗粒结构。

离子交换剂的骨架是具有网孔状结构的颗粒状凝胶，而荷电功能基团均匀分布在凝胶颗粒的表面及网孔内部，可交换分子依据分子量的不同，不同程度地进人凝胶颗粒内部，将荷电功能基团上的反离子置换下来而自身结合到离子交换剂上。