第五章 蛋白质组与新药开发

• 核酸作为药物作用的靶标实际上存在着致命的 缺陷： • (1)首先由于核酸结构的同源性 • 联系到许多人类正常的功能，作用于 DNA 的药 物大多选择性差，而且毒性较大，特别是形成 共价结合的药物都有严重的细胞毒作用。 • (2) 其次大多数疾病都是表征在蛋白质水平上， 而不是在基因水平上。 • 细胞和组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度相关 性不显著(仅为0.5)；
• ③用于与靶DNA杂交的流体系统。 • ④读取芯片的扫描仪。 • ⑤定量分析和解释结果的完善的软件程序。 • 另外还需要从生物材料中提取核酸以备分析的 工具。 • 基因芯片(genechip)及蛋白质芯片(proteinchip) 均属于生物芯片，都是近年来发展起来的新的 生物技术。现在它们越来越多地应用到生物学、 医学、遗传学、药理学和毒理学等多个方面， 并开始崭露头角。
• 都有其他方法无可比拟的优越性。
• 生物芯片技术至少由5部分组成： • ①具有特殊表面的芯片本身。
• ②在芯片上点布或原位合成核酸 (或蛋白 质)探针得到微阵列的设备。 • 布阵的质量直接影响微阵列分析的结果 • 目前喷泡 (bubble jet) 技术和寡核苷酸的 无屏蔽原位(maskless in situ)合成技术的 建立使微阵列分析技术得到很大提高。
• 疾病的发生与发展、药物的作用大多是在蛋白 质水平上进行的。 • 蛋白质组学研究克服了蛋白质表达和基因之间 的非线性关系。 • 将蛋白质组应用于新药研究，可以通过对疾病 与正常细胞中的蛋白质组进行比较，发现可以 成为药物筛选的作用靶标的、与一些疾病相关 的蛋白质。 • 而新药及其靶标的发现和药物作用的模式研究 是药物蛋白质组学的重要研究内容。
• 这些技术是药物早期开发成功的关键。
• 由于许多疾病与信号传导途径异常有关，因而 信号分子可以作为治疗药物设计的靶点。 • 在信号传递过程中涉及成百上千个蛋白质，蛋 白质--蛋白质相互作用发生在细胞内信号传递 的所有阶段。 • 这种复杂的蛋白质作用的串联效应可以完全不 受基因调节而自发地产生。 • 通过与正常细胞作比较，掌握与疾病细胞中某 个信号途径活性增加或丧失有关的蛋白质的改 变，将为药物设计提供更为合理的靶点。
• 如果能发现在耐药细胞系中表达异常的蛋白质 或者与细胞毒性密切相关的蛋白质，就可以此 蛋白为靶点设计用于联合用药的新化学单位 (new chemical entities)。 • 也可以此信息为参考，设计避免产生耐药性或 毒副作用的药物。
• 造成癌症病人死亡率极高的主要原因是 肿瘤的转移
• 现在国内一些实验室已开始利用蛋白质 组学技术，通过对高低转移细胞株蛋白 质的比较， • 来寻找与肿瘤转移相关的蛋白质。
• 近年来，随着分子生物学的不断发展， 越来越多的单基因遗传病的基因被克隆 出来。
• 利用基因芯片检测容量大的特点，可根 据某个遗传病的特定基因，设计一组包 含能检测该基因各外显子上所有可能出 现突变的 DNA 序列位点的寡核苷酸探针， 制成一张芯片。
• 利用杂交时会出现碱基错配杂交信号减弱的特 性，经计算机分析扫描信号，将该基因上的杂 合性突变检测出来，
• 蛋白质芯片的两种常用的分离手段： • （1）保留色谱 • （2）预活化芯片表面
• • • • 用于蛋白质芯片表面的色谱主要有： 反相色谱 离子色谱(阴离子和阳离子)交换色谱 金属亲和色谱等
• 预活化表面主要是基于蛋白质之间的专 一性作用。 • 如：抗原一抗体结合和受体一配基等。
• 通过对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分 析，发现一些疾病不同时期的蛋白标志物。 • 这样不仅对药物发现具有指导意义，还可形成未 来诊断学、治疗学的基础理论。
• 癌症被称为当今人类的一大天敌，因而抗肿瘤药 的开发也就成了科学家们研究的重点。
• 现今大多数抗癌药都伴有严重的毒副作用，特 别是对晚期癌症病人进行单一化疗或联合放疗、 过热疗法时，经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂 耐药性的发生。
• 第十五章
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蛋白质组与新药开发
第一节 简介 第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系 一、基因芯片 二、蛋白质芯片 第三节 药物的高通量筛选体系 一、高通量筛选 二、计算机虚拟筛选 第四节 药物作用的监测评价体系 一、临床前安全性评价 二、临床试验 三、生物技术药物的开发
• 第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系 • 在药物研发中，疾病靶标有两个含义： • 靶基因 • 靶蛋白
• 靶基因的概念： • 通常，我们首先需要了解影响某一疾病的基因 ( 整个代谢途径上的基因 )，其中一个或一系列 基因就称为靶基因。 • 靶蛋白的概念： • 靶基因确定之后，就有可能针对与此疾病相关 的某一个基因产物——蛋白质设计药物，这种 蛋白质就确定为靶蛋白。
• 一、基因芯片及其应用
• 基因芯片概念： • 基因芯片又称 DNA 或 cDNA 微阵列 (DNA or cDNA microarray)，是指在面积很小 的载体上，点布数以万计不同的寡核苷 酸或cDNA， • 将芯片与标记有荧光染料的待测 DNA 或 mRNA杂交，
• 与靶序列配合好的探针会产生强烈的杂 交信号
• 二、蛋白质芯片
• 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(protein microarray) • 蛋白质芯片是继基因芯片之后，作为基因芯片功 能的补充发展起来的。
• DNA基因芯片为描绘不同组织的mRNA表达谱 提供了可能，并且得到了广泛的应用。 • 一个基因在转录时也许以多种mRNA形式剪接
• 而同一种蛋白质可能会以多种形式进行翻译后 修饰， • 蛋白质组中蛋白质的数量可能超过基因组的数 量。 • 所以更能反映生物体机能的是蛋白质表达谱， 而不是mRNA表达谱。 • 蛋白质芯片的发展使得在同一时相分析整个蛋 白质组成为可能。 •
• 蛋白质组学技术可以让人们清楚地了解： 细菌内哪些蛋白质会在抗生素的作用下 发生改变，以及发生何种变化。 • 根据这些变化，并以蛋白质作为新药设 计的靶点，筛选出新一类的抗生素。
• 同时还可选取一些耐药菌株，考察其耐 药机制
• 第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系 • 思考题：
• 1 什么叫基因芯片？ • 2 生物芯片技术组成部分有哪些？ • 3 什么叫蛋白质芯片？
• 目前，已有许多新技术新方法可加快这一阶段 的研究： • • • • • • 生物信息学(bioinformatics) 体外或体内表达技术(in vivo or in vitro express) 超高通量(ultra high throughput)仪器 微阵列技术(microarrays) 反义技术(anti-sense) 蛋白质组学(proteomics)技术等等
• 在欧美一些国家，将HGP的研究和新药开 发结合在一起，创立了一门新的学科， 叫药物基因组学(pharmacogenomics)。 • 它以基因组学为基础，以研究开发新药 为目的。 • 在基因水平上对疾病敏感度、药物反应 和副作用进行分析和研究。 • 是药理学当中的一个新分支。
• 药物基因组学含义： • 药物效应的基因型预测和基因组学在医 药工业上的应用， • 在分子水平上证明和阐述药物疗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，药 物作用的靶标、作用模式和毒副作用。
• (3)第三，将核酸结合的药物释放到相应 的组织是一大难题。
• (4)第四，很多疾病如癌症和心血管疾病 往往是多基因共同作用的结果。 • 因此很难找到关键基因作为作用的靶标 • 以上几点都是制约新药开发进程的瓶颈。
• 为了阐明生命活动的本质，真正与功能 研究结合，基因组的研究必然要回归到 蛋白质组研究。 • 蛋白质的结构、分布和功能： • 对于预测某些疾病的进程、药物作用及 其过程。 • 对于阐明不同个体之间遗传学上的差异 是非常重要的。
• 生物芯片 (biochip) 技术是近几年才发展 起来的一种高通量、微型化和自动化检 测技术，又称微阵列(microarray)分析技 术。
• 它应用于生命科学的许多领域： • 疾病相关基因的发现 • 疾病分子诊断 • 预测及基因功能研究等(见图)。
• 在药物领域:
• • • • • 对于药物靶标的发现 多靶位同步超高通量药物筛选 药物作用的分子机理 中医药基础理论现代化 药物活性及毒性评价等方面
• 为了尽快发掘到具有可成为疾病标志物 或药物作用靶标的蛋白质， • 蛋白质组学技术向高通量 ( 大规模 ) 和自 动化方向发展。 • • • • 评价蛋白质组学技术发展的标准： 高灵敏度 高准确度 高重现性
• 蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用 下表达异常的蛋白质的方法。 • 这种蛋白质可以作为药物筛选的作用靶点。
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这就在很大程度上促进了相关科技的高速发展。 基因组学 组合化学 高 通 量 筛 选 ( high—throughput screening， HTS) • 三种技术的联合应用使得新药研制的成本得到 大幅度下降。 • 加速了具有特定靶标的新化合物的发现。 • 人类基因组测序工作的完成，也将为药物的寻 找提供更多的可供筛选的靶标。
• 第十五章 蛋白质组与新药开发 • 第一节 简介
• 目前世界上存在的已知疾病大约有4500种，其 中只有不到二分之一的疾病有相应的治疗手段， 可以有药物对应的疾病甚至不到四分之一
• 一个新药从开发到上市，历经十几年的时间， 研究开发经费可达十几亿美元。 • 可是，一旦上市以后，它所带来的利润也是相 当可观的。
• 企图从这几个发展阶段上缩短周期，加 快新药上市的速度是很困难的。 • 这几个阶段的周期长短，不但受新药研 究规律所制约，也受药品审批管理法规 要求的限制。
• 针对上述难题， • 新药研制机构， • 特别是各国的制药企业公司纷纷加大人力、财 力的投入力度， • 将热情和注意力倾注在新药发现过程上， • 大量使用现代新技术， • 寻找切实可行的解决方案，以期抢占制药行业 的先机。
• 可见新药的研究开发具有广阔的前景， 是一个周期长、高风险、高投入、高回 报的产业。 • 当代创新药物研究竞争十分剧烈，其中 竞争的焦点就在于筛选新药，问题的核 心是低成本、高效率地筛选出新药，以 达到缩短新药发现过程的目标。
• 在医药工业，发现一个新药后，临床前 药理、毒理学研究平均需要3.5年。 • 临床试验平均需要6年。 • 审批上市平均需要2.5年。 • 三者相加平均12年。
• 并分析出该突变位点在突变后有无mRNA表达、 表达后翻译的蛋白质功能变化的可能情况。 • 使得一次检测就可以完成对一系列疾病的基因 诊断。
• 单张芯片上容纳的寡核苷酸探针越多
• 一次检测能够诊断的基因遗传病种类也 越多。 • 随着基因芯片产量的增加，价格也会逐 步下降，使得对基因遗传病的诊断和产 前诊断在实际中的应用成为现实。
• 如果有碱基的错配，信号就会减弱。
• 籍此能判断靶 DNA 或 mRNA 中与芯片相 应基因的突变或表达等情况。
• 它的特点是：
• 一次性检测样本量大 • 成本相对低 • 计算机自动分析结果以及快速、准确等。
• 因此适于靶 DNA 或 mRNA 的高通量筛选。
• 在 肿 瘤 研 究 和 诊 治 方 面， Wang 等 将 576 6 种 cDNA 点布在一张基因芯片上，用它检测正常 卵巢组织和卵巢肿瘤之间各基因表达的差异。 • 鉴定了在卵巢癌变过程中起着重要作用的几种 基因，这也为肿瘤的诊断和治疗带来了新的方 法和途径。 • 另外还有多种癌症组织被人们用这种方法所研 究，这些肿瘤基因表达谱的研究对于肿瘤的分 类和提供癌症的新型基因靶标提供了可能。
• 同样也可以高转移株中特异表达的蛋白 质为靶点，开发抑制肿瘤转移的新药。
• 在抗生素方面，由于传染病仍是死亡的 主要原因，因而抗感染药是近年来各国 新药开发的热点之一。
• 面对抗生素耐药问题以及不断出现新的 微生物的感染性疾病，老的方法显得束 手无策。 • 其根本原因就在于对药物的作用机制缺 乏透彻的认识。 • 。