高通量药物筛选与创新药物研究

亚克隆
大肠杆菌表达系 统
酵母表达系统 昆虫表达系统
大规模表达、 纯化、复性， 得到纯净重组
蛋白
分子水平筛选模型建立流程
检测方法的确 定、优化及高 通量筛选模型
的建立
光吸收 时间
HO
N N
O
NS HO
O
O
H
N
OEt
N H
O
O
O
H
N
OEt
HS
N
H
O
O
COOH
O2N
S
S
NO2
HOOC
COOH
S
NO2
E412nm =13,600 M1cm-1
均相检测
异相检测
放射性检测
非放射性检测
SPA 微粒
显色反应检测Байду номын сангаас
SPA 微孔板
吸收光检测 荧光检测
微粒方法检测
放射性检测
非放射性检测
过滤方法检测 吸收方法检测 沉淀方法检测 放射免疫
ELISA 检测
O
No2
RN H
E
No2 H2N 405nm=1.06×104 M-1cm-1
显色反应 (Photometry)
O
E
RS
R'
N
O
H
O
HS
R'
N
H
O2N
SS
NO
2
HO2C
CO2
H
O
HS
NO2 + O2N
SS
R'
N
H
CO2H
HO2C
412nm=1.4×104 M-1cm-1
显色反应方法检测MetAP活性
S
N H2N
O O
N
H
MetAP HN
NO2 Met
ON H
N
OH + H2N
NO2
HO
maxnm
NO2
ProAP
靶点确证
• Expression phenotype ? • Mutant ? • Antisense treatment ? • Antibody treatment ? • RNAi ? • Knockout / knockin ? • Inhibitor treatment ?
克隆
PCR、RT-PCR方 法从cDNA文库、 EST克隆、组织和 细胞的总RNA中 得到关键靶基因
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Donor
Fluorescence
模型设计
• 体外生化检测
–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、 受体、蛋白与蛋白的相互作用等
• 细胞水平的检测
–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子 通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型
通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测 技术测量生物反应的终点。
体外生化检测
体外生化检测
高通量药物筛选与创新药物研究
内容
• 高通量药物筛选：
模型建立、化合物制备、自动化、数据处理
• 我国高通量药物筛选的现状 • 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：
组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活 性化合物作用机制
• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例
尺寸变化
生物大分子 +
生物大分子 +
竞争性结合
生物大分子
FP 信号增强
+
生物大分子
FP 信号减弱
F P 信 号 减 弱 +
IMAP
Protein-DNA Binding FP HTS
Ser/Th Kinase Competitive FP Assay
荧光共振能转移(FRET)
荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将 激发的能量转移到受体的现象。这种方法可检测生理 状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三 个条件：供体和受体间距离接近（10~100埃）；供体 的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受 体之间迁移偶极子的方向必须平行。
显色反应方法检测MetAP活性
S
R O
MetAP
S
OH
H2N
N
O
HO
R=Ph,CH3
Met
O2N
R O
HS
OH
N
HO2C
HO
SS
R O
HS
NO2 + O2N
SS
OH N
CO2H
HO2C
HO
NO2 CO2H
=412nm
荧光强度 (Fluorescence Intensity)
7-amino-4-methylcoumarin
要素一：高通量筛选模型建立
针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并 使之适用于高通量筛选。
选择高通量筛选的靶点
来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理 解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键 的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、 激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。
化合物资源
药物发现 DRUG DISCOVERY
1.药物先导化合物的发现 2.药物先导化合物的结构优化
药物候选化合物
药物开发 DRUG DEVELOPMENT
1. 临床前研究 2. 临床研究
新
新 药 研 究 的 两 个 阶 段
天然产物 化学合成 组合化学
化合物库
筛选模型
分子生物学 细胞生物学
基因组学 蛋白组学
高通量筛选 技术
—药物发现的关键环节 —高新技术集中的焦点
筛选 结构优化 先导化合物
生物信息学 结构生物学 计算机辅助药物设计
药物化学
高通量筛选（HTS）
运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的 筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的 活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上 方可以称为高通量筛选。
rhodamine 110
resorufin
Fluorogenic Peptide Substrate
荧光偏振 (Fluorescence Polarization)
偏振光
快速旋转 方向随机
低 的 FP信 号
偏振光
生物大分子
旋转减慢，偏振光 方向集中在偏振面上
强 的 FP 信 号
FP
Theoretical FP Behavior of a Series of Fluorescent Dyes As a Function of MW
The Evolution of HTS
高通量筛选
• 快速----每天筛选上万药次 • 微量----筛选样品需要量为微克级 • 灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性 • 经济----筛选费用低
常规筛选和高通量筛选
高通量筛选
常规筛选
高通量筛选的四个要素
HTS
样品制备 自动化
数据处理 模型建立
Current Drug Targets
• Membrane Receptors • Enzymes • Hormones and Factors • Ion Channels • DNA • Nuclear Receptors • Unknown
45% 28% 11%
5% 2% 2% 7%
N = 483 J. Drews, Science (2000) 287:1962